免疫荧光技术

1、免疫荧光技术免疫荧光技术（immuno fluoresce nee tech nique ） 又称荧光抗体技术。始 创于40年代初，1942年coo ns等多次报道用异氰酸荧光素标记抗体。它是在免 疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。免疫荧光技术包括荧光抗体技术和荧光抗原技术，因为荧光色素不但能与抗体球蛋白结合， 用于检 测或定位各种抗原，也可以与其他蛋白质结合，用于检测或定位抗体，但是在实 际工作中荧光抗原技术很少应用，所以人们习惯称为荧光抗体技术，或称为免疫 荧光技术。该技术的主要特点是：特异性强、敏感性高、速度快。主要缺点是：非特异 性染色问题尚未完全解决，结果判定的客

2、观性不足，技术程序也还比较复杂。一、实验的基本原理免疫学的基本反应是抗原-抗体反应。由于抗原抗体反应具有高度的特 异性，所以当抗原抗体发生反应时，只要知道其中的一个因素，就可以查出另一 个因素。免疫荧光技术就是将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体（或抗原）上，与其相应的抗原（或抗体）结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧 光反应。二、实验方法1、直接法这是荧光抗体技术最简单和基本的方法。滴加荧光抗体于待检标本片上，经 反应和洗涤后在荧光显微镜下观察。标本中如有相应抗原存在，即与荧光抗体特 异结合，在镜下可见有荧光的抗原抗体复合物。此法的优点是简单、特异。但其 缺点是检查每种抗原均需制备相应

3、的特异性荧光抗体，且敏感性低于间接法。待检图一、直接免疫荧光法原理示意图2、间接法根据抗球蛋白试验的原理，用荧光素标记抗球蛋白抗体 （简称标记抗抗体）的方法。检测过程分为两步：第一次，将待测抗体（第一抗体）加在含有已知抗原 的标本片上作用一定时间，洗去未结合的抗体。第二，滴加标记抗抗体。如果第 一步中的抗原抗体已发生结合，此时加入的标记抗抗体就和已固定在抗原上的抗 体（一抗）分子结合，形成抗原-抗体-标记抗抗体复合物，并显示特异荧光。此法 的优点是敏感性高于直接法，而且无需制备一种荧光素标记的抗球蛋白抗体， 就 可用于检测同种动物的多种抗原抗体系统。亦可用荧光素标记葡萄球菌a蛋白。代替标记抗球

4、蛋白抗体用于间接法荧光染色，且不受第一抗体来源的种属限制， 但敏感性低于标记抗抗体法。间接法有时易产生非特异性荧光， 为其缺点。此法 常用于各种自身抗体的检测。如果第一抗体为已知，间接法也可用于鉴定未知抗 原。荧光标记抗抗体抗原 抗体图二、间接免疫荧光法原理示意图由于免疫球蛋白有种属特异性，因此标记的抗球蛋白抗体必须用第一抗体同种的动物血清球蛋白免疫其他动物来制备用一种标记的抗球蛋白抗体，能与在种属上相同的所有动物的抗体结合， 检查各种未知抗原或 抗体，敏感性高。缺点是：由于参加反应的因素较多，受干扰的可能性也较大，判定结果有时较难，操作繁琐，对照较多，时间长。间接法应设阴、阳性标本对 照，还

5、应设有中间层对照（即中间层加阴性血清代替阳性血清）。3. 抗补体染色法抗补体染色法简称补体法，是间接染色法的一种改良法，首先由Goldwasser 等建立。本法利用补体结合反应的原理，用荧光素标记抗补体抗体， 鉴定未知抗原或未知抗体（待检血清）。染色程序也分二步：先将未标记的抗体 和补体加在抗原标本上，使其发生反应，水洗，然后再加标记的抗补体抗体。如果第一步中抗原抗体发生反应，形成复合物，则补体便被抗原抗体复合物结合， 第二步加入的荧光素标记的抗补体抗体便与补体发生特异性反应， 使之形成抗原 - 抗体-补体- 抗补体抗体复合物，发出荧光抗补体染色法具有和间接法相同的优点， 此外，还有其独特的优

6、点： 即只需 要一种标记抗补体抗体，便能检测各种抗原 - 抗体系统。因为补体的作用没有特 异性，它可以与任何哺乳动物的抗原 - 抗体系统发生反应。它的缺点是参与反应 的成分多，染色程序较复杂，比较麻烦。除上述三种方法外， 还有在此基础上演变出的一些方法， 如双层法、夹心法、 混合法、三层法、抗体 - 抗补体法等等。三、荧光抗体的制备1. 免疫血清的制备及免疫球蛋白的提纯为此，用于免疫的血清的效价与特异制备高效价的特异性抗血清是免疫荧光技术成功的前提。抗原必须高度提纯， 尽可能不含其他非特异性的抗抗原物质， 性是矛盾的， 通常以高效价的免疫血清为好， 因为用这种血清制备荧光抗体， 即 使其中含有

7、少量非特异抗体， 也可以通过稀释法将其除去。 为提高血清效价， 在 制备免疫原时， 通常采用大剂量加佐剂， 长程免疫， 其中以弗氏不完全佐剂最常 用。即按抗原 1份，无水羊毛脂 1 份，液体石蜡 2份混合，待充分乳化后，免疫 动物，即可能获得高效价的免疫血清。 用于荧光素标记的免疫血清， 需提纯后使 用，这样不但可以提高抗体的效价，而且还可以排除丫球蛋白以外的蛋白质， 减 少非特异性荧光的出现。 从免疫血清中将特异性抗体提纯于荧光素标记是免疫荧 光技术的关键一环。 在免疫荧光技术中所应用的特异性抗体， 主要是 IgG 类，其 提纯方法很多， 但以饱和硫酸铵盐析法比较简便， 也可用分子筛层析法

8、（即葡聚 糖凝胶过滤），以及离子交换层析法等，或先用盐析法精提，然后再经过层析柱 进一步纯化。2. 荧光色素的标记 能够产生明显荧光并能作为染料使用的有机化合物称为荧光色素或荧光染 料。用于标记抗体的荧光色素， 必须具有化学上的活性基因， 能与蛋白质稳定结 合，且不影响标记抗体的生物活性及抗原抗体的特异性结合。 适于标记蛋白的荧 光色素主要有异硫氰酸荧光黄（fluorescein isothiocyanate ，FITC），四乙基 罗达明（rho-damine B200 , RB2O0和四甲基异硫氰基罗达明（tetramethyl rhodamine isotheynate , TMRITC。

9、实际上目前应用最多的只有异硫氰酸荧光黄 一种。（1）FITC标记 FITC为黄色结晶形粉末，分子量为 389,易溶于水和酒精 等溶剂中，溶解后呈黄绿色荧光，最大吸收光谱为490-495nm, FITC的溶液不稳 定，易因水解或迭聚而变质，故需在配好后 2h 内应用。FITC含有异硫氰基，在碱性条件下能与IgG的自由氨基（主要是赖氨酸的 & -氨基）结合，形成荧光抗体结合物。一个分子的IgG有86个赖氨酸残基，但 一般最多只能标记 15-20 个。 直接标记法 取抗体球蛋白溶液10ml，碳酸盐缓冲液3ml，生理盐水 17ml，混合，在4C电磁搅拌下加FITC3mg（先溶解在3ml缓冲液中），在4

10、C 继续搅拌4-6h，将结合物通过已平衡好的 Sephadex G5柱，以除去未结合的游 离荧光素。 透析标记法 将抗体球蛋白溶液用碳酸盐缓冲液（ 0.25mol/L ， pH9.0 调动1% （W/V ），并装入透析袋中，按蛋白质量的 1/20称取FITC溶于10倍抗体 溶液量的碳酸盐缓冲液中，将透析袋浸没于FITC液中，于4C搅拌16-18h取出透析袋于0.01mol/L ,pH7.2PBS中透析4h,将结合物通过已平衡好的 SephadexG25 柱，去除游离荧光素。（2）RB 200标记 本品为无定形褐红色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮，性质稳定，可长期保存，分子量为 580,最大吸

11、收光谱为570nm呈明亮的橙色 荧光，因与FITC的黄绿色有明显区别，故被广泛用于对比染色或用于两种不同 颜色的荧光抗体的双重染色。方法为：取1g RB200及五氯化磷（PCL） 2g放乳钵中研磨5min （在毒气操作橱中），加10ml无水丙酮，放置5min,随时搅拌， 过滤，用所得溶液进行结合。将每亳升血清用1ml生理盐水及1ml碳酸盐缓冲液（0.5mol/L , pH9.5）稀释，逐滴加入0.1ml RB200溶液，随加随搅拌，在0-4 C 继续搅拌 12-18h 。（3）TMRITC标记 TMRITC为紫红色粉末，性能比较稳定，分子量为 443, 最大吸收光谱为550nm呈橙红色荧光。其

12、结合方法与FITC的直接标记法相同， 只是所加色素量为蛋白质量的 1/30-1/40 ，结合时间持续 16-18h。（4）影响标记的主要因素 温度、时间、酸碱度和标记量 4个因素。温度 低，标记时间长，温度高，标记时间应短。FITC 0-4 C以6-12h为宜，20-25 C以1-2h为宜，37E 30-45min为宜。pH低时，标记较慢，pH值偏高（大于10）, 抗体易变性，pH值9.0-9.5最为适宜。抗体蛋白含量低，标记慢，以每毫升含 20-25mg蛋白为宜。至于标记方法，各有特点，但均不能去除非特异荧光染色因 素。透析法适用于小体积的标记。3. 标记抗体的纯化抗体标记以后， 应立即进行

13、纯化处理， 以消除或降低非特异性染色和特异交 叉染色。其步骤如下：标记抗体溶液J透析或凝胶过滤 去除游离荧光色素（粗制荧光抗体）J DEAE纤维素层析去除过度标记的蛋白分子（精制荧光抗体）J抗原交叉吸收或组织制剂吸收 去除特异交叉反应的标记杭体（免疫纯荧光抗体） 根据免疫荧光试剂的具体用途， 纯化的方法可以不同， 并不是每一种荧光试 剂都须经过以上全部过程。 对于某些细菌诊断试剂， 只要除去游离荧光素就可以， 检测病毒抗原的荧光抗体一般要求下述处理：（1）游离荧光素的去除 去除标记过程中未与蛋白质结合的游离荧光素， 是 纯化标记试剂的最基本要求， 不经过这一步处理， 任何免疫荧光试剂都不能应用

14、。 半透膜透析法 利用荧光色素分子可以通过半透膜，而蛋白分子则因分 子量大不能通过的原理， 逐步将游离色素除去。 先将标记好的抗体溶液装于透析 袋或玻璃纸袋内， 注意使液面上留有一定空间， 扎紧袋口， 先用流动自来水透析 5 min ，再转入 PBS （ 0.01mol/L ，pH7.2） 或生理盐水中继续透析，外液量至少 大于内液量100倍，透析应在低温（0-4 C）下进行，每天换液3-4次，整个透 析时间约需 1 周左右， 时间过长容易造成蛋白质变性， 影响荧光抗体的质量。 取 透析液（外液）以紫外线灯检查，若无荧光出现，即可停止透析。 凝胶过滤法 利用荧光色素分子和蛋白质分子量的悬殊差别

15、，通过分子筛除去游离荧光素，一般 1h 以内即能完成操作，但最好与透析法结合进行。先 将标记抗体溶液透析4 h,除去大部分游离荧光素和其他小分子物质以后，再进 行凝胶过滤，这样有利于保护凝胶柱，延长使用时间。凝胶柱sephadex G25和Go装好后，以洗脱液（0.001mol/L 或 0.005mol/L PBS，pH7.0-7.2 ）平衡，然 后加入样品， 样品与柱床容积的比例 1:2 以下皆可。 样品全部进入柱床后， 即可 进行洗脱。应用此法可使游离荧光素完全除去，同时荧光抗体可以100%回收。（2）过度标记的蛋白分子的去除 去除游离荧光素后， 结合物中存在的未标 记的和过度标记的蛋白质

16、， 是降低染色效价和出现非特异性染色的主要因素。 常 用的方法是DEAE纤维素或DEAD葡聚糖凝胶层析，结合物通过层析柱后，过度 标记的部分（易出现非特异性）被吸附，过低标记的或未标记的部分（易降低敏 感性）自由流出，从而可以得到荧光素与蛋白质结合比最适的部分。DEAD纤维柱用PBS平衡后，柱上端放一大小合适的滤纸片，打开下口，调 解流速至每分钟10-20滴左右，待柱上液面剩一薄层PBS时，用吸管滴加标记样 品，样品进入柱床尚离一薄层时，用适量PBS冲洗管壁，然后用大量0.01mol/L， PH7.2PBS洗脱，用20%磺基水杨酸液试测洗脱液。待蛋白出现阳性反应时即可收 集，蛋白反应阴转时停止

17、收集，该洗脱液即为纯化的标记抗体。(3) 特异交叉或额外应用性标记抗体的去除 去除特异交叉或额外应用标 记抗体，常用组织粉末吸收法， 最常用的是肝粉， 这一步处理对标记的抗体来说， 损失是很大的，一般可省去这一步。4. 标记抗体的鉴定经过以上各种程序所获得的精制荧光抗体， 使用前须做特异性测定、 敏感性 鉴定以及纯度测定后，才可正式用于荧光抗体染色。四、荧光抗体染色1. 标本的固定在荧光抗体试验中， 染色标本的固定是个很重要的步聚。 通过固定， 不仅要 使标记的抗体易于接近抗原， 从而发生反应， 而且要求标本中的抗原的活性不受 损失，同时还要保护其自然形态和位置。 因此，根据所研究的抗原和组织

18、细胞种 类的不同， 相应地采用不同的固定方法。 应用最广泛的固定液是丙酮和乙醇， 其 次是甲醇、甲醛、丙烯醛等。切片标本大多用乙醇固定，组织培养标本主要用丙 酮固定。固定液的浓度：丙酮为 100%，乙醇为 100%或 95%，甲醛为 10%，甲醇为 100%。固定的温度和时间变化很大，温度从-70 C至37C都有应用，时间一般 在 10-30min 。2. 染色(1) 直接染色法 于标本片上滴加适当稀释的荧光抗体，置湿盒内，37r感作30min后取出。 先以pH7.2 PBS冲洗，继以自来水冲洗5min左右，最后以蒸馏水冲洗， 自然干燥或吹干。 滴加缓冲甘油封片(无荧光甘油 9份， pH7.2PBS 1份)镜检。 对照的设立本自发荧光对照：已知抗原标本加 1-2滴PBS或不加，应无荧光出现。 抗原对照：已知抗原加正常同种动物标记球蛋白溶液染色，应无荧光。阻抑试验： 标本滴加同种未标记抗体感作 30min 后，再加标记抗体， 镜检应 无荧光现象。种属抗原染色：标记抗体与种属抗原标本染色，应无荧光出现。阳性对照： 标记抗体与已知抗原染色， 应呈强荧光反应。 对照染色可根据条 件适当选择。(2) 间接法