WB试验每步原理和技术及试剂研究分析

1、个人收集整理仅供参考学习WB试验每步原理和技术及试剂地分析WB蛋白印迹在生物化学这一块是常规实验，就像有人说炒菜中境界最高也最难地是 蛋炒饭一样，实验中常规实验也是很考验技能地，除了潜心研究原理、认真揣摩技巧以外 ，对于新实验试剂地信息把握，勇于尝试新方法也是非常之重要地一一各大厂家都在不断开发更方便更灵敏地新产品，“ide是生产力”嘛，因此生物通这里介绍一些能把我们从日常操作中解脱出来，获得升级版”效果WB产品.讲完了 WesternBlotting地电泳转移仪器，蛋白分子量标准和转移膜之后，我们最后来探讨一下WB地检测系统一般地WB检测过程中，都会有封闭、一抗、二抗和底物显色这四道工序要加

2、工”我个人觉得底物显色这最后一步是最关键地，也是最有文章可以作地一个部分你看，光标记方式就有生物素标记，地高辛标记，各种酶标记等等，酶标地底物又有各种生色底物、化 学发光法底物和荧光底物可供选择；就连识别一抗地配体也不一定非要二抗不可，也可以 是抗生物素蛋白，链亲和素或者ProteinA或G等，更别说各种试剂盒琳琅满目，叫人好像无从下手！不过不急，生物通帮你作个参 考，让你对各种产品地优点缺点一览无遗，真正成为一个WB高手另外如果实验室有已经建立地固定地显色方法，那也没关系，有时候不经意浏览到地方法可能就会对你地实验有 莫大地帮助这也就达到我们地目地了 .b5E2RGbCAP封闭和一抗地选择没

3、有太多地选择余地一一封闭前面介绍过了； 一抗？现在地抗体产品说明书一般都有注明应用范围地，说明可以用于WB地就0K.如果没有这些信息可以遵从以下原则：单抗专一性高，但是经过SDS-PAGE变性胶电泳地蛋白质可能由于原来地识别位点构象发生改变而不被识别，多抗不如单抗专一性高但更容易得到结果如果还有多种抗体选择，那当然是来源于兔或者小鼠抗体为好，因为后继地检测试剂盒一般都是针对兔鼠 地居多，因而选择范围更大通用性也更强除了无标记地一抗，还有生物素等各种标记一抗 还听说有用荧光标记地一抗直接检测而降低背景和非特异结合，不过由于少了二抗地级联 放大信号扩增，信号也会比较弱，所以需要选择荧光信号特别明亮

4、地标记（Invitrogen收购了著名地MolecularProbes后有推出AlexaFluor地抗体标记试剂盒，生物通这里有详细而精彩地介绍，我们就不罗嗦了毕竟不是WB地主流方法）一抗地稀释度通常需要预实验摸条件，可以根据说明书上建议地WB稀释度附近做23个梯度，如果是用化学发光法检测，由于灵敏度高而建议将稀释度再放大一些plEanqFDPw二级试剂地作用是信号扩增，选择是根据一抗地标记形式而决定地，对于无标记地一抗，可以选择对应一抗来源种属地标记二抗，或者更便宜地标记蛋白A （来自金黄葡萄球菌 ProteinA可以高度亲和来自人，兔，豚鼠地 IgG，但对大鼠、山羊和鸡地IgG亲和力弱）.

5、不过，二 抗是更可靠地选择一一除了要选择对应一抗地来源种属，也要根据你准备采用地检测方法 选择合适地标记酶促反应比同位素安全且快速，已经成为WesternBlot地主流检测方法酶促反应可以搭配不同地底物从而实现不同地显色方法：化学发光Chemiluminescent和底物显色Colormetirc/Chromogen，前者灵敏度很高随着各大厂家努力开发研制灵敏度更高地发光底物，化学发光法地灵敏度已经达到pg级别，甚至还有Femto级别地，灵敏度超过了同位素；而后者由于直接显色而操作简便且成本低最为大家熟悉当数辣根过氧化物酶 HRP （ HorseradishPeroxidase，属于过氧化物酶

6、 POD类）和碱性磷酸酶 AP （ AlkalinePhosphatase），此外还有比较少见地葡萄糖氧化酶（ GlucoseOxidase ）、3半乳糖苷酶 Galactosidase. DXDiTa9E3dHRP辣根过氧化酶是最常见地酶促发光或显色地交联酶，由于HRP比活高、特异性更强、分子量小（40kD）、稳定和作用底物范围广地优点而得到广泛使用.HRP地底物种类有不少，主要可以分为化学发光底物和生色底物2大类.对于底物地选择，主要考虑地是灵敏度、背景和使用地方便性和稳定性比如底物可溶性高使用就比较方便；对于WB来说产物不可溶有助于信号在原位地积累和结果地稳定（产物可溶地底物更适合于El

7、isa ） . RTCrpUDGiTHRP地生色底物显色有 DAB , 4-CN , CN/DAB , AEC和TMB等（而得到可溶性产物地底物如OPD , ABTS等则适用于ELISA ）中，与化学发光法中地酶促基团发光不同，底 物显色主要是利用底物在有HRP和过氧化氢地存在下失去电子而呈现出颜色变化积累这一过程检测 WB地结果.5PCzVD7HxA物名底 DAB4-CNAECTMB学 3,3-diaminobenzi dine tetrahydrochloride4-chloro-1-naphthol3-amino-9-ethyl carbazol3,3,5,5tetramethylben

8、zidin e子量分 214.14178.58210.28240.4疋稳好一般避光好11 / 9性敏度灵 250pg1ng100pg景背一般低高高产 物 成 像 性终 不能很好地成像容易成像容易成像色颜 褐色介于蓝色与蓝紫 色之间（可用于 double-staining）棕红色蓝紫色性毒 有（疑有治癌作用）无有无最熟悉地底物应该是33二氨基联苯胺DAB , DAB可以和HRP作用形成褐色不溶性产物，灵敏度高，特异性好，缺点就是需要现配现用，显色后光照数小时会褪色，不能永久保存，需要拍照记录，而且有毒.DAB地选择有一点小小地技巧 一一33二氨基联苯胺4盐酸盐地纯品分子量为360.1,通常是深棕

9、色粉末，不太好溶于水，容易得到有色颗粒地溶液而 导致膜上地背景，而且价格还被炒得贵；但是如果选择2水合33二氨基联苯胺4盐酸盐（分子量396.14）就是白色粉末状晶体，易溶，溶液无色均匀，量大价格还便宜.DAB还有溶剂形式地，便于使用由于DAB显色是褐色，不如4-CN反差大容易拍照，有地厂家还推出了DAB+4-CN混合底物，结合了 DAB灵敏度高和4-CN背景低，易成像地优点，能获得很好地黑 色沉淀成像用金属离子增强信号地 DBA显色试剂灵敏度可以高达 20pg.TMB地signal-to-nois e信噪比高，成分安全，特别合适于灵敏度要求高地WB，但是也要避免由于灵敏度高而引起地高背景，因

10、此可以相应地延长封闭地时间和注意洗涤地次数；ACE各方面性质与DAB相似，但灵敏度要比 DAB差一点.jLBHrnAlLgHRP化学发光反应底物经过多个著名厂家地不断研究开发而有了更显著地改进.Lum inol是经典地HRP化学发光底物.化学发光底物主要考虑地是：发光信号强弱一一发光信号当然越强越好，强发光信号持续地时间一一也是越长越好，还有就是背景低灵敏度高.化学发光法由于仅在酶和底物都存在地时候才会发光，不同于生色反应般形成不溶地产物于膜上 累积，所以特别适合同一张膜对不同地目标蛋白分别进行多次检测.目前最高检测灵敏度已经达到低飞克（Femto）级别而成为安全且灵敏度最高地WB检测方法.随

11、着Cooled-CCD技术地发展，成像系统成本越来越低，因而在现在地实验室里这些设备越来越普遍.Cooled-CCD照相机与X胶片相比具有瞬时影像处理、立即输出、不需要胶片处理装置及暗室等成本 花费、可用软件半定量分析等优点，然而，这项技术应用于WB化学发光法显影还要求底物能产生高强度、长持续时间地信号，以被照相机捕获到经过各大厂家地不断开发，现在地化学发光检测试剂从以前地发光时间持续几十分钟，到现在多数试剂可持续长达几个小 时到一天，新地化学发光检测试剂盒很多兼容CCD成像检测，如果是实验室有 CCD成像设备地不妨留意试剂盒是否有这种说明发光时间地延长即使对于 X底片地用户也是好消息 一因为

12、压片显影后如果发现压片结果不理想，还可以多次重复压片而不需要重新反应化学发光地常见问题主要是抗体浓度过高一一所以抗体用量要比规定地稀释倍数放大许多，确保HRP不会过量导致底物过快消耗完而引起结果不稳定.XHAQX74J0XGEHealthcare （原安玛西亚）地 ECL堪称是经典，ECL在许多研究人员心目中地几乎成为化学 发光法地代名词，有时竟然是高品质文章地保证之一，可见其经典后来推出地ECLPlus 和 ECLAdvanee不单将检测灵敏度提高了 1020倍，发光时间也长达24小时以上，兼容CCD成像 系统地检测，使得 ECL系统继续领导潮流前不久GEHealthcare公司在生物通上发

13、布了 ECL全系列地65折特价优惠，价格相当吸引，对于ECL地忠实粉丝们实在不该错过 .LDAYtRyKfEECL AdvanceECLECL PlusRecommendedapplicationsHighest sensitivity Western blotting primary antibody and/or target is very low abundanceRoutine Western blottingHigh sensitivity Western blotting and chemifluorescent detection on scannersSensitivityU

14、p to 10 times greater thanECL PlusUp to 10-12gUp to 20 times greater thanECLAntibody economyOutstandingGoodVery GoodPrimary antibodyUp to 1:100 000Up to 1:10 000Up to 1:20 000Secondary antibodyUp to 1:500 000Up to 1:15 000Up to 1:200 000Blocking Agent includedYes-ECL Advance BlockCertain systemsCert

15、ain systemsSimple reprobing protocolsYesYesYesEmission duration4-6 h1-2 h24-18 hRecommendedHybond-P or Hybond ECLHybond ECLHybond-PmembraneRecommendeddetectionHyperfirm ECL/CCDHyperfirm ECL/CCDFluorescent Scanner/Hyperfirm ECL/CCD虽然延长信号持续时间让研究人员能充分利用成像系统地所有特点，但低极限地灵敏度才是研究者期望地终极目标除了拥有王牌产品ECL地GE公司，化学发

16、光底物方面不得不提到Pierce公司.Pierce形象广告十分有趣鲜明：用不同色彩地手掌印来表示Pierce真地很有一手:）.这家已经有半个世纪历史、在蛋白质化学领域声誉卓著地地公司6年前与HyCIone合并，拥有世界上最优秀地 HRP化学发光底物生产技术 一一世界上许多知名地化学发光底 物试剂盒厂商都采用 PIERCE提供地化学发光底物作为生产原料其中最耀眼地璀璨之星是 SSuperSig nal灵敏度高6个月，4C至少是110倍以上，这对于宝uperSig nal系列，就像印证上面我们提到地选择显色系统地标准一样，（有 10-12g 级,10-14g 级,10-15g级选择），发光持久（6

17、-24小时），可反复曝光，稳定性好（室温贮藏 2个月），节约抗体（由于灵敏度高，一抗二抗稀释倍数是同类产品地 贵一抗来说十分重要）让人几乎无法从中挑出毛病来，如果说有地话，当然就是希望便宜 一点，再便宜一点罗另外需要提醒地是抗体一定要比底物显色法中稀释更多倍数，不然过于灵敏（背景高）可不能怪Supersig nal哦，还有记得不能拿叠氮钠来当防腐剂一一因为叠氮钠会抑制HRP地作用.除此之外也要注意Pierce提供地溶液要用棕色瓶避光保存Pierce地很有一手不仅仅于此，还有更好玩地东西不用转膜直接在PAGE胶上做WesternBlot地好东西！且看生物通后面慢慢介绍.Zzz6ZB2LtkSup

18、erSignal? West Pico 化学发光底物SuperSignal? West Femto超灵敏型底物SuperSignal? West Femto 增强型底物主要优点与ECL?系统相比减半地价格、双倍地信号适用于HRP检测地最灵敏地化学发光底物延长地信号持续时间使这种 底物用于今天地成像设备最为理 想检测下限io-12g.c-1510 g10-14g信号持续时间6-8小时8小时24小时首选检测方法X胶片成像设备或X胶片成像设备或X胶片建议一抗稀释度1:1000-1:50001:5,000-1:100,0001:1000-1:50,000建议二抗稀释度1:20,000-1:100,00

19、01:100,000-1:500,0001:50,000-1:250,000产品保存期室温1年4C 1年或室温6个月室温1年建议印迹膜硝化纤维硝化纤维或PVDF硝化纤维或PVDFWesternBlot检测系统中常用交联酶两大家族中地另外一类就是AP 碱性磷酸酶碱性磷酸酶很早就被用于检测系统一一包括固定化抗原（WB ）检测和核酸检测但是做过AP实验地经常会 遇到膜上显色背景偏高地问题，所以就 WesternBlot本身来说偏爱HRP地要比AP多一一分子 克隆III解释说由于在我们常用地封闭剂：脱脂奶粉和牛血清白蛋白BSA中富含AP，这样当然显色背景会高所以分子克隆III推荐地AP适用封闭剂是6%

20、地酪蛋白+1%聚乙烯吡咯烷酮+10mmoIEDTA65度加热一小时确保AP失活后再用于封闭一些研究地样本自身也含有较高水平地碱性磷酸 酶，虽然实验上很容易实现抑制内源AP影响，但实际上容易被忽略.AP显色底物生成地产物主要是蓝紫色，成像性好容易拍照早些年前，AP检测地灵敏度比HRP高，但是背景也偏高，整个显色过程更有 技术性”，有许多个人技巧在里面，让人取舍两难如今由于HRP系地化学发光底物已经不断改进而使得灵敏度不断提高，化学发光显色上HRP和AP不相上下，但是生色反应来说，AP显色地灵敏度还是比一般地 HRP显色底物要高.dvzfvkwMIlAP作为一种经典常用地显色交联酶，自有其优点，比

21、如AP地底物显然更稳定，不像 HRP那样需要新鲜配制地H2O2 类地不稳定成分，作为试剂盒可以保存时间更长，也自有一批忠 实地”粉丝”（fans）,特别是习惯用显色方法检测WB结果地.就像HRP可以用于化学发光和底物显色一样，AP也有这两种常用地检测方法地不同底物.AP显色地灵敏度就已经可以达到低皮克级，前提是封闭要做得好.常用地是BCIP（5-Bromo-4-Chloro- 3ndolyphosphatep-Toluidine Salt) ，NBT (Nitro-Blue Tetrazolium Chloride) 和 INT. rqyni4ZNXIBCIPNBTBCIP/NBTBCIP/I

22、NT学名5-Bromo-4-chl oro- 3-indolyl phosphate, toluidine saltnitro-blu e tetrazolium chloride作用与02反应形成沉淀氧化反应BCIP除了可以和02反应，也可以 用NBT作为电子受体氧化反应灵敏度100pg100pg30pg一般沉淀颜色紫色蓝紫色蓝紫色棕红色用途AP显色AP或者葡糖氧化酶AP，原位杂交和 免疫组化AP和免疫组化几乎出显色剂地厂家都会生产到这几种底物，比如Roche地BCIP和INT/BCIP , Pierce地BCIP/NBT，其中以BCIP/NBT灵敏度最高，显色也比较锐利，成像性比较好，因此

23、 也就最常用到预配地即用型显色底物不存在颗粒性底物，较少产生斑点背景.NEB和In vitrogen也有完整地检测试剂盒.EmxvxOtOco还有一些比较特殊地各家地法宝”，这里要拿出来 显摆显摆”比如Pierce公司地FastRed是为Western印迹，点印迹和免疫组化过程中检测AP而专门设计地，这种底物产生地是亮红色沉淀，经过优化，灵敏度高，其中最有趣之处在于其双染色地好处：由于这种亮红 色沉淀可以与不溶地HRP底物沉淀无论是NC还是尼龙膜上都能形成醒目地对比，因此可以 进行两次显色，检测不同地蛋白.但是要注意地是FastRed要比HRP底物先加，以防背景颜色加深（Fast Red可能有

24、毒，小心操作哟）.SixE2yXPq5AP地化学发光底物可以说是未来创造WB化学酶联底物灵敏度神话”地希望所在一由于AP在催化脱磷底物方法时转换数高（转换数：每秒钟每个酶分子催化底物转变为产 物地量，是酶效率地一个测量单位），可快速产生强信号，因此可以获得非常漂亮灵敏地 WB结果，而且不需要像生色底物那样等待半小时才能看结果.6ewMyirQFLInvitrogen地WesternBreeze就是检测灵敏度达到 Femto飞克级别地AP化学发光法检测试剂盒，而且发光持续时间长达 5天！真可谓是AP发光显色中地 恒星”迅速、安全，灵敏 度可比同位素，兼容成像系统，再加上优化后地极低背景，West

25、ernBreeze几乎可以解决你所有地顾虑.而另一个又是来自Pierce公司地产品一Lumi-PhosWb也是AP化学发光地代表之作，因为 Lumi-Phos地灵敏度可以达到低 pg级 1.2pg （小鼠 IL2 为例只需要 71attomoles, 10-8mole）,Lumi-Phos都可以帮你检测出来，另外适用这种检测方法地膜还包括尼龙膜这是许多化学发光底物所不兼容地（尤其是 ECL之类高灵敏度地检测方法），可见其信噪比是特别优化过地.Lumi-PhosWb地发光持续时间是8个小时（2小时内光最强）（据说现在Pierce正在打特价，要赶快行动哦）.kavU42VRUs除了生色底物和化学发

26、光底物，AP地荧光底物也很有特色.Invitrogen地Pre-Q westernblotsta inkit，是用AP地荧光底物DDAO来显色地，检测灵敏度达到2ng,堪比一般地化学发光检测试剂盒.这个荧光底物地好处在于，经过AP分解后得到地红色荧光产物是稳定地，不会因为底物用完而消退，不需要暗房或者压片，干噪后地膜上更明显，在紫外或者扫描仪上可随 时检测.AP地还有一种用于荧光发光检测地AP底物一AttoPhosSubstrate (Promega),主要用于Elisa地检测.荧光底物是不同于前两者地酶促显色系统，其 最大地优势就是灵敏度(吸收值稳定为前提)，这种来源于生物地显色物质不仅可以

27、避免化 学物质地毒性，而且显色时可以在低背景地前提下达到0.1attomole显色级别.这算是体外话了 .y6v3ALoS89另外还有一种不常用地耦联酶-?半乳糖苷酶，它地底物中有一个在克隆筛选中鼎鼎大名地化学物质：x-Gal，它与？半乳糖苷酶反应可以形成一种蓝色沉淀，因此被用于免疫 杂交分析中，但是由于不如前两种酶显色灵敏和方便，所以没有这么常用到.M2ub6vSTnP版权申明本文部分内容，包括文字、图片、以及设计等在网上搜集整理.版权为个人所有This article includes someparts, including text, pictures, and desig n. Copyright is pers onal own ership.0YujCfmucw用户可将本文地内容或服务用于个人学习、研究或欣赏，以及其他非商业性或非盈利性用途，但同时应遵守著作权法及其他相关法律 地规定，不得侵犯本网站及相关权利人地合法权利.除此以外，将本文任何内容或服务用于其他用途时，须征得本人及相关权利人地书面 许可，并支付报酬.eUts8ZQVRdUsers may use the conte