贞清方调节SREBP-1c减少糖尿病大鼠肾脏脂质沉积

1、贞清方调节SREBP-1c减少糖尿病大鼠肾脏脂质沉积文秀英，1 许明旺，2 胡勤瑾，3 罗琼，3 鲁敏，3（1.华中科技大学同济医学院附属梨园医院中西医结合科，武汉430077；2. 华中科技大学同济医学院附属梨园医院老年医药学研究所；3. 华中科技大学同济医学院硕士研究生）摘要：目的 探讨贞清方对糖尿病大鼠肾脏脂质代谢的调节作用及其分子机制。方法 高糖高脂饲料加低剂量链脲佐菌素注射制备2型糖尿病大鼠模型，将成模大鼠分为：贞清方组、二甲双胍组、模型组，另设正常对照组，每组18只大鼠。分别在治疗8周和12周时检测大鼠的肾皮质TG含量。12周时，采用RT-PCR检测肾皮质固醇调节元件结合蛋白-1c

2、 （SREBP-1c）和脂肪酸合成酶（FAS）的mRNA表达，同时，检测血糖、血甘油三酯（TG）、 总胆固醇（TC）和尿微量白蛋白排泄率(UAE)， 肾脏行HE染色、在光镜下作肾组织形态学观察。 结果 8周时模型组肾皮质TG含量有增高的趋势，但与正常组比较无显著性差异(P>0.05)，两治疗组的肾皮质TG含量与正常组比较无明显变化。12周时，与正常组相比，模型组大鼠肾皮质TG含量显著升高（P<0.01）, 且SREBP-1c和FAS mRNA 的表达明显上调（P<0.01）。贞清方组和二甲双胍组肾皮质TG含量较模型组明显减少（P<0.01）。贞清方组SREBP-1c m

3、RNA的表达非常显著低于模型组（P<0.01），二甲双胍组的SREBP-1c mRNA表达亦低于模型组（P<0.01），但高于正常组（P<0.05）。贞清方组和二甲双胍组的FAS mRNA表达均显著低于模型组（P<0.01）。与模型组比较，两治疗组血糖、TG和UAE明显下降（P<0.01），TC亦下降（P<0.05）。贞清方组和二甲双胍组的肾脏病理改变较模型组减轻。 结论 贞清方可通过下调糖尿病大鼠肾组织SREBP-1c及其下游基因FAS mRNA的表达，减少肾脏的脂肪沉积，改善肾功能和形态学改变。关键词 ：贞清方；糖尿病肾病；固醇调节元件结合蛋白-1c；脂

4、肪酸合成酶 基金项目：国家自然基金资助项目（30672730）作者介绍：文秀英，女，博士，教授,主任医师。*通讯作者：许明旺，女，副主任药师，Telemail:hailen2006Zhenqing Recipe Reduce Lipid Accumulation in Diabetic Rat Kidney by Regulating Expression of SREBP-1c mRNAWEN Xiu-ying, XU Ming-wang，HU Qin-jin,（ Liyuan Hospital , Tongji Medical College， Huazhong

5、 University of Science and Technology, Wuhan 430077, China）ABSTRACT: OBJECTIVE To investigate Zhenqing Recipe(ZQR) in regulation of renal lipid metabolism and its molecular mechanisms. Methods Type 2 diabetic rat model was established with feeding high-glucose and high-fat diet, and injecting low do

6、se streptozotocin. The model rats were divided into: untreated model group, ZQR group, metformin group, normal rats served as control, 18 rats in each group. At week 8 and week 12 after treatment, TG contents in renal cortex were measured. And at week 12, the expression of sterol regulatory element

7、binding-protein- 1c (SREBP-1c ) and fatty acid synthase (FAS) mRNA were detected by RT-PCR. Meanwhile, fasting blood glucose (FBG), total triglyceride (TG) and total cholesterol (TC) and urine albumin excretion (UAE) were measured. Kidney histomorphology was observed by the light microscope with HE

8、staining. RESULTS At week 8 , the level of TG in renal cortex had a tendency to increase in model rats, however, there was no difference with control (P>0.05). And the level of renal TG showed no obvious change in two treated groups. At week 12 , the renal TG was higher in untreated model rats co

9、mpared with control(P<0.01). In contrasted to control, expression of SREBP-1c and FAS mRNA in model group were up-regulated (P<0.01). Contents of renal TG in ZQR and metformin groups were decreased compared with model group (P<0.01). The expression of SREBP-1c was significantly down-regulat

10、ed in ZQR group than model group (P<0.01). And expression of SREBP-1c mRNA in metformin group was also decreased compared with model group (P<0.01)，but it is higher than control(P<0.05). Both treated groups showed lower level of FAS mRNA than those of model group (P<0.01). The level of F

11、BG, TG and UAE in two treated groups was significantly decreased (P<0.01), and TC was also lower than those of model group (P<0.05). Pathological changes were ameliorated in ZQR and metformin groups compared with model group. CONCLUSION ZQR decrease renal fat deposit through down-regulation of

12、 SREBP-1c and FAS mRNA expression in type 2 diabetic rats. Therefore, it improve renal function and morphology.KEY WORDS : zhenqing recipe; diabetic nephropathy ; sterol regulatory element binding-protein- 1c; fatty acid synthase糖尿病状态异常的脂质代谢引起肾脏脂质沉积在糖尿病肾病（DN）的发病及病理进程中起着重要作用1 。DN的血脂异常表现为TG、TC、LDL-C升高

13、，HDL-C下降， VLDL可增高2,3。脂质代谢异常可出现脂质在肾脏沉积、直接损伤肾脏4,5；还引起TGF1 的表达增强、诱导肾小球系膜细胞外基质大量合成1；肾小球脂质沉积，单核- 巨噬系统吞噬增加,泡沫细胞形成，发生类似于动脉粥样硬化的血管损伤，导致肾小球硬化与肾功能受损3,6。固醇调节元件结合蛋白（Sterol Regulatory Element-binding Protein，SREBPs）属于碱性-螺旋-环-螺旋-亮氨酸锌指(bHLH-ZIP)转录因子， 在调节脂肪合成、脂肪酸自稳态和组织细胞脂肪沉积方面起关键作用7,8。SREBPs家族由SREBP-1和SREBP-2两个成员组成

14、, SREBP-1有两个亚型：SREBP-1a和SREBP-1c。亚型 SREBP-1c位于17pll.2染色体, SREBP-1c作用于脂肪酸合成酶（FAS）等靶基因 9，控制游离脂肪酸和甘油三酯的生物合成， 在糖尿病肾病的发病中介导TG在肾脏沉积10。 过度表达SREBP - 1c 的PEPCK promotor 转基因小鼠，显现系膜增生、基质积聚，蛋白尿增加 11。前人对SREBP-1c及其靶基因FAS与糖尿病肾病的关系的研究主要是对STZ诱导的1型糖尿病大鼠和基因鼠的研究1,11。人类糖尿病95%为2型糖尿病，其发病与高糖高脂饮食有关，目前用高糖高脂诱导再加小剂量链脲佐菌素注射所致的2

15、型糖尿病模型已在国内外得到认可12,13，这种模型的肾脏SREBP-1c的表达情况如何还未见报道。本次实验采用高糖高脂加小剂量链脲佐菌素注射所致的2型糖尿病模型，在我们以前证实贞清方对这种2型糖尿病大鼠肾脏病变有防治作用的基础上 14 ，研究贞清方对SREBP-1c及其下游基因FAS的调节作用，进一步探讨贞清方防治DN的分子机制。1材料与仪器1.1 实验动物纯系7周龄雄性Wistar大鼠(清洁级)72只, 体重150170g。购自湖北省医学科学院实验动物中心，饲养于华中科技大学同济医学院附属梨园医院清洁级动物房，标准饲料喂养，自由饮水。1.2 药品与试剂葡萄糖、甘油三酯和胆固醇试剂盒（北京北化

16、康泰临床试剂有限公司），链脲佐菌素(美国Sigma公司), 尿微量白蛋白放射免疫分析测定盒（北京北方生物技术研究所）。Trizol、MMLV逆转录酶、RNAase Inhibitor、dNTP和Oligo(dT)（日本 TOYOBO公司），TaqDNA 聚合酶、DNA Marker I（北京TIANGEN公司），引物序列（美国Invitrogen公司）。盐酸二甲双胍（中美上海施贵宝制药公司）。女贞子、山药和地龙等中药饮片（武汉银杏中药饮片厂）。1.3 仪器AU-400全自动生化仪（日本Olympus公司），PCR仪（德国Eppendorf 公司），GENEGENIUS成像仪（美国GENE公司）

17、，5415R型4离心机（德国eppendorf公司），UV4802H型紫外可见分光光度仪（上海尤尼柯仪器有限公司），显微镜及显微摄像仪（日本Olympus公司）。2 方 法2.1药物制备贞清方中的女贞子和山药等植物药采用水煮醇沉法，过滤浓缩，以提取干膏收率和齐墩果酸（女贞子的主要成分）作为综合评价指标；地龙采用水提、浓缩，以次黄嘌呤作为控制指标。将提取液混合即得贞清方提取液，配置液为3g生药/ml，40C保存。二甲双胍用蒸馏水配制成30mg·ml-1的混悬液，40C保存。2.2 动物模型的建立、分组及处理随机将大鼠中的18只用于作正常对照组，喂以常规饲料；另54只用于建立2型糖尿病模

18、型 12，高糖高脂饮食喂养1个月后，给予30mg/kg 链脲佐菌素（STZ） (用0.1mol·L-1柠檬酸缓冲液配制成2%溶液, pH4.4) 一次性腹腔注射， 1周后尾静脉采血测空腹血清血糖，以空腹血糖大于11.1mmol/L,定为造模成功。分组：糖尿病模型大鼠分为贞清方组，给予贞清方提取液26g·kg-1·d-1灌胃；二甲双胍组，给予二甲双胍混悬液150mg· kg-1·d-1；模型组和正常组给予蒸馏水灌胃。每组均为18只大鼠。各组均于每天上午8-10时灌胃一次。治疗持续12周，每周称重一次，根据体重变化调整给药剂量，每月观察摄食量和饮水

19、量的变化。2.3 标本收集分别于注射STZ后1周、造模成功后给药12周尾静脉采血（采血时间均为上午8时），分离血清，用于测血糖和血脂。用药第8周，每组各取6只大鼠，断头处死，迅速打开腹腔, 游离并摘除肾脏, 放置80冰箱冻存，用于检测肾皮质TG含量。 其余大鼠继续饲养。用药第12周，各组以代谢笼收集24h尿，用二甲苯防腐，记录尿量，混匀后留取少量尿标本放置-200C冰箱中，用于测尿微量白蛋白。最后断头处死大鼠，迅速打开腹腔,游离并摘除双肾,左肾去包膜后沿正中剖开, 置于10%中性福尔马林液中固定,用于作病理检测。右肾立即置液氮中、继之移置80冰箱冻存，用于作SREBP-1c 和FAS mRNA

20、表达检测，以及肾皮质TG 测定。2.4 指标检测2.4.1生化指标的测定血糖用葡萄糖氧化酶法；血脂用酶偶联比色法；尿微量白蛋白(UAE)检测用放射免疫法。2.4.2 组织病理学观察肾组织经10%的福尔马林液固定后,常规石蜡包埋，制作连续切片、厚约4µm，分别行HE染色。光镜下观察肾组织形态学改变。2.4.3 肾皮质TG含量测定参考Folch方法15：从-80冰箱中取出肾脏，切取同一部位肾皮质100mg，加入20倍体积(2ml)氯仿甲醇（2：1）匀浆液，冰浴匀浆后，于室温下缓慢摇动过夜，3000r·min-1离心10min，取上清液加入0.2倍体积生理盐水，充分混匀，静置10

21、min后3000r·min-1离心10min，除去上层液相，下层有机相在真空抽干机中抽干后加入1ml无水乙醇充分溶解后在自动生化仪上检测TG含量，同时设置空白无水乙醇对照。2.4.5 RT-PCR测定肾皮质SREBP-1c mRNA 和FAS mRNA的表达从80冰箱中取出肾脏，切取少量肾皮质，提取总RNA，用紫外分光光度计测定OD260、OD280，计算比率及RNA浓度。每个样本取总RNA 5ug，20ul反应体系逆转录合成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增。目的基因的引物和内参照-actin引物设计根据其核苷酸序列、用Primier 5.0软件设计，序列如下：SREBP-

22、1c：上游引物：5-GGAGCCATGGATTGCACATT-3下游引物：5-AGGAAGGCTTCCAG AGAGGA-3FAS： 上游引物：5-CTGGACAGCATTCCAAACCT-3下游引物：5 -GGCTC TGGTGGCTTCTAGTG-3-actin： 上游引物：5-CCAAGGCCAACCGCGAGAAGATGAC-3 下游引物：5-AGGGTACATGGTGGTGCCGCCAGAC-3反应总体积为25ul，其中10×buffer 2.5ul，dNTP 2ul，上下游引物各1.0ul，TaqDNA聚合酶0.5ul，cDNA模板1ul，DEPC18ul。PCR反应条件

23、： 94预变性5min，94变性45s，57退火45s，72延伸1min，72后延伸7min，共30个循环。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶（含goldview50l·L-1）电泳，-actin为内参照，用genesnap紫外凝胶系统摄像， genetools进行图像分析，确定条带的质量值（quantity），结果用目的基因的质量值/-actin的质量值表示。3 统计学分析所有数据应用SPSS13.0统计软件进行统计分析,结果以表示,多组间均数的比较采用One-Way ANOVA，组间均数的比较采用q检验。4 结 果4.1 动物的一般情况成模后各组表现出多饮、多食、体重增加，治疗后二甲

24、双胍组和贞清方组的摄食量、饮水量和体重明显低于模型组（数据从略）。实验过程中正常组有1只被咬伤剔除，模型组有2只死亡，二甲双胍组和贞清方组各有1只死亡。4.2 给药12周各组大鼠血清FBG、TG 、TC和UAE的比较（见表1）治疗12周后，与模型组比较，贞清方组和二甲双胍组FBG和TG均显著降低(P<0.01)、 TC含量亦降低(P<0.05)、UAE非常显著减少（P<0.01）。表1 贞清方治疗12周对大鼠FBG、TG 、TC和UAE的影响，Tab. 1 Effects of ZQR on FBG, TG, TC and UAE level in type 2 diabet

25、ic rats after 12 weeks treatment，nFBG(mmol/L)TG(mmol/L)TC(mmol/L)UAE(ug/24h)Control114.51±0.720.85±0.491.79±0.6169.72±38.06Model1016.29±3.70 2)1.86±0.23 2)4.98±0.82 2)596.74±96.52 2)Metformin1010.37±2.12 2) 4)1.27±0.19 1) 4)4.36±0.69 2) 3) 255.9

26、5±83.73 2)4)ZQR109.46±1.93 2) 4)1.12±0.17 1) 4)4.23±0.66 2) 3) 239.82±91.96 2)4)注：与正常组比较1)P<0.05，2)P<0.01；与模型组比较3)P<0.05, 4)P<0.01。Note: compared with control group, 1)P<0.05，2)P<0.01；compared with model group, 3)P<0.05, 4)P<0.014.3 肾脏的组织形态学变化：正常组肾组织结

27、构清晰，模型组肾小球系膜细胞和细胞外基质增生、基底膜增厚、肾小球节段性硬化；二甲双胍组和贞清方组肾小球体积较正常增大，但系膜基质增生及基底膜增宽较模型组有明显改善，未见明显的肾小球硬化（图1）。 A B C D图1各组大鼠肾小球的形态改变,HE染色 (×400）A. 正常组； B.模型组； C.二甲双胍组；D.贞清方组。Fig.1 Morphological changes of glomeruli stained with HE(×400）A - Control; B - Model; C - Metformin; D - ZQR 同时，对肾小管也进行了观察，光镜下见正常

28、组肾小管结构清晰，肾小管上皮细胞胞浆红染，核蓝。模型组肾小管上皮细胞出现重度脂肪变性和水样变性，细胞体积明显增大，细胞界限不清，胞浆透明，整个细胞膨大如气球，故又称气球样变。二甲双胍组和贞清方组肾小管上皮细胞轻度水样变性及脂肪变性，细胞体积轻度增大，胞浆淡染，较透明，胞核颜色变淡（见图2）。 A B C D 图2各组大鼠肾小管的形态改变，HE染色 （×400）A. 正常组； B.模型组； C.二甲双胍组；D.贞清方组。Fig.2 Morphological changes of renal tubules stained with HE(×400）A - Control;

29、B - Model; C - Metformin; D - ZQR4.4 各组大鼠肾皮质TG含量比较（见表2）成模第8周，模型组肾皮质TG含量有增高的趋势，但无显著性差异(P>0.05)，两治疗组的肾皮质TG含量与正常组比较无明显变化。12周时，模型组大鼠肾皮质TG含量显著升高（P<0.01）, 二甲双胍组和贞清方组肾皮质TG含量较模型组明显减少（P<0.01）。表2 不同治疗时程大鼠肾皮质TG的变化，mg/100mg kidney tissueTab. 2 Changes of renal TG contents in rats at different time cour

30、se of treatment, ，mg/100mg kidney tissuenWeek 8TG Week 12 n TGControl60.154±0.06311 0.169±0.057Model60.189±0.07410 0.294±0.087 1)Metformin60.150±0.05911 0.201±0.079 2)ZQR60.162±0.06111 0.195±0.075 2)注：与正常组比较1)P<0.01；与模型组比较2)P<0.01Note: compared with cont

31、rol group, 1)P<0.01；compared with model group, 2)P<0.01 4.5 肾皮质SREBP-1c和FAS mRNA 的表达模型组SREBP-1c和FAS mRNA 的表达显著高于正常组（P<0.01）。与模型组比较，贞清方组SREBP-1c mRNA的表达非常显著下调（P<0.01），二甲双胍组的SREBP-1c mRNA表达亦显著下调（P<0.01），但仍高于正常组（P<0.05）。贞清方组和二甲双胍组的FAS mRNA表达均显著低于模型组（P<0.01），见表3、图3。表3 贞清方对大鼠肾皮质SREBP

32、-1c和FAS mRNA表达的影响，Tab. 3 Effects of ZQR on SREBP-1c and FAS mRNA levelin rats kidney, nSREBP-1c FASControl110.308±0.0530.268±0.037Model100.581±0.0662)0.489±0.051 2)Metformin110.362±0.0501) 3) 0.308±0.045 3)ZQR110.326±0.054 3)0.315±0.048 3)注：与正常组比较*P<0.05，*P

33、<0.01；与模型组比较P<0.01Note: compared with control group, 1)P<0.01, 2)P<0.01；compared with model group, 3)P<0.01100 bp200 bp300 bp400 bp500 bp600 bp100 bp200 bp300 bp400 bp500 bp600 bp100 bp200 bp300 bp400 bp500 bp600 bpFASSREBP-1c-actin A B C D Marker 图3 各组大鼠肾SREBP-1c和FAS mRNA表达SREBP-1c，1

34、91 bp；FAS，397 bp；-actin，589 bp。A. 正常组；B.模型组；C.二甲双胍组；D.贞清方组。Fig. 3 SREBP-1c and FAS mRNA expression in rats kidneySREBP-1c，191 bp；FAS，397 bp；-actin，589 bp。A - Control; B - Model; C - Metformin; D - ZQR5 讨 论本实验用高糖高脂加小剂量STZ制备了2型糖尿病大鼠模型，于造模成功后的第8周检测各组中部分大鼠的肾组织TG含量，模型组肾TG有增高的趋势，但与正常组比较无显著性差异，说明在8周时肾脏的脂质沉

35、积不严重。造模成功后的第12周模型组肾组织 TG含量显著增高。模型组大鼠的肾脏病理学检查可见肾小球系膜细胞和细胞外基质增生，基底膜增厚，肾小球节段性硬化；肾小管上皮细胞出现重度脂肪变性和水样变性。这说明随着造模的时间延长，肾脏出现了脂质损害的特征，脂质代谢异常是肾脏病变进展的部分原因。脂代谢异常引起糖尿病肾病的分子机制目前认为与SREBP-1c介导TG在肾脏沉积、引起肾脏损害有关。SREBP-1c直接调节FAS基因的表达，FAS通过催化乙酰辅酶 A和丙二酰辅酶 A而合成长链脂肪酸，以TG的形式存储16,17。有研究表明单纯高糖高脂饲养的C57BL/6J小鼠16和单纯STZ注射的1型糖尿病大鼠1

36、，均出现SREBP-1c 和FAS高表达和肾组织TG含量增高。本实验对大鼠喂以高糖高脂饲料加上小剂量STZ注射建立模型，结果表明SREBP-1c和FAS mRNA在模型组大鼠肾组织高表达，这与模型组肾脏出现的脂质损害有关。我们的工作发现在造模的第12周出现明显的肾脏脂质沉积，这对后人利用此模型来研究糖尿病肾脏脂质代谢的情况奠定了基础。调节SREBP-1c的表达可减少脂质对肾脏的损害，敲除小鼠的SREBP-1c基因，可防止小鼠由于高脂饮食所致的肾脏TGF-、PAI-1和VEGF表达的增强以及细胞外基质的聚积 18，亦可防止小鼠由于STZ注射所致的蛋白尿12。有学者用二甲双胍治疗脂肪肝，发现二甲双

37、胍可降低SREBP-1c mRNA及蛋白表达,从而改善肝脏脂肪变性19 。本实验观察贞清方对2型糖尿病大鼠肾脏脂质代谢的影响，研究发现贞清方能下调SREBP-1c mRNA和FAS mRNA的表达，减少肾组织TG含量，同时，采用二甲双胍作为对照用药，结果显示二甲双胍也有相似的效果。两药均能降降低血糖和血脂，改善肾脏的病理损伤，减少尿微量白蛋白的排泄。以SREBP-1c及其下游基因作为靶点来研究中药治疗糖尿病肾病的药效机制有较好的应用前景，值得深入探讨。REFERENCES 1 SUN L, HALAIHEL N,ZHANG W, et al. Role of sterol regulatory

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