钠氢交换蛋白-1特异性抑制剂二甲基氨氯吡咪对HL-60ADM细胞pHi变化及细胞增殖、凋亡的影响

1、钠氢交换蛋白-1特异性抑制剂二甲基氨氯吡咪对HL-60/ADM细胞pHi变化及细胞增殖、凋亡的影响         08-03-03 16:34:00     编辑：studa20          作者：常城，孔佩艳，陈幸华，彭贤贵，刘林，刘红，曾东风，梁雪，王庆余【摘要】  为了探讨钠氢交换蛋白-1（NHE-1）抑制剂二甲基氨氯吡咪（DMA）对HL-60/ADM细胞pHi变

2、化及细胞增殖、凋亡的影响，以敏感HL-60细胞为对照，用不同浓度的DMA干预后，荧光指示剂（BCECF/AM）检测法检测细胞内pHi，微量噻唑蓝法（MTT）检测细胞生长的抑制率，流式细胞术检测细胞周期变化，TUNEL法检测原位细胞凋亡，对比HL-60/ADM细胞与HL-60细胞之间的差异。结果显示： HL-60/ADM细胞内pHi较HL-60细胞显著升高；DMA作用下，HL-60/ADM细胞的pHi降低幅度、生长抑制率、细胞凋亡率均显著高于HL-60细胞；当DMA浓度100-150 mol/L时，HL-60/ADM细胞的G0/G1期细胞比率增加幅度、S期及G2/M期细胞比率降低幅度均高于HL-

3、60细胞。 结论： NHE-1特异性抑制剂DMA引起HL-60/ADM的pHi降低，可抑制细胞生长并诱导细胞凋亡；且DMA对HL-60/ADM细胞的生长抑制作用显著高于HL-60细胞。 【关键词】  钠/氢交换蛋白-1Effect of the NHE-1-Specific Inhibitor DMA on pHi，Proliferation and Apoptosis of HL-60/ADM Cells In VitroAbstract    The aim of this study was to evaluate the effect of di

4、methyl amiloride (DMA)，a specific inhibitor of Na+/H+ exchanger-1 (NHE-1)，on intracellular pH value(pHi)，proliferation and apoptosis of HL-60/ADM cells in vitro. After  treatment  with DMA at different doses，pHi of HL-60 and HL-60/ADM cell lines were determined by using pH-sensitive fluore

5、scence dye BECEF-AM;  the rate of growth inhibition of cells was detected with MTT assay;  cell cycle was detected by flow cytometric DNA analysis; cell apoptosis was observed with terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL). The results showed that pHi in

6、 HL-60/ADM cells was higher than that in HL-60 cells. After treatment  with DMA at different doses，pHi decreased，the rate of growth inhibition and the rate of apoptotic cells in HL-60/ADM cells were all higher than those in HL-60 cells. Meanwhile，after treatment with DMA during 100 mol/L to 150

7、 mol/L，the increase amplitude of  G0/G1 phase cells  and the decrease amplitude of  SG2/M  cells in HL-60/ADM cells were higher than those in HL-60 cells. It is concluded that by  causing intracellular acidification，the NHE-1-specific inhibitor DMA inhibits proliferation

8、0; of  HL-60/ADM cells   and induces apoptosis of HL-60/ADM cells，and the degree of this growth inhibition of HL-60/ADM cells is higher than that of HL-60 cells.Key words  NHE-1;  dimethyl amiloride; HL-60/ADM cell; pHi; cell proliferation; apoptosis钠/氢交换蛋白-1（Na+/H+exchanger

9、-1，NHE-1）广泛存在于真核细胞膜上，介导细胞内外11钠/氢交换以维持细胞内的pH值（intracellular pH value，pHi）。NHE-1表达增高和（或）活化可引起细胞内碱化，促进细胞增殖，相反则可导致细胞内酸化，促进细胞凋亡1，2。凋亡抑制是白血病多药耐药（MDR）产生的重要机制之一3，本研究以HL-60细胞株为对照，检测NHE-1特异性抑制剂二甲基氨氯吡咪（dimethyl amiloride，DMA）作用下，阿霉素诱导产生多药耐药的HL-60细胞株（HL-60/ADM）pHi改变及其细胞增殖、凋亡变化，探讨DMA对HL-60/ADM细胞生长的影响。材料和方法材料细胞株H

10、L-60细胞株由第三军医大学复合伤研究所提供。阿霉素诱导的耐药HL-60细胞株(HL-60/ADM)购自天津中国医学科学院血液学研究所，实验前经检测证实，该细胞株对临床常用多种化疗药物耐药，细胞表面表达多药耐药相关蛋白（MRP），细胞内拓扑异构酶（Topo）增高。试剂及仪器 BCECF-AM购自美国Eugene公司，RPMI 1640培养液、标准胎牛血清为美国Hyclone公司产品，尼日利亚菌素（nigericin）、DMA、噻唑蓝（MTT）、二甲亚砜（DMSO）购自美国Sigma公司。其他常规试剂为国内试剂公司产品，分析纯。美国PE公司LS-50B荧光分光光度计，国产酶联免疫分析仪

11、。氯化钠缓冲液（PSS，pH 7.4，37）、氯化钾缓冲液（37下用1N盐酸和1N氢氧化钾分别调定pH为6.8、7.0、7.2、7.4、7.6）参照文献4自行配制。MTT溶于PBS液，工作液浓度为5 mg/ml。细胞培养用含10胎牛血清的RPMI 1640培养液（用1N盐酸调节pH值至7.2），于饱和湿度，5 CO2、37培养箱中培养。HL-60/ADM细胞株常规培养加入阿霉素0.5 g/ml，实验前无药培养1周。pHi检测荧光强度比值（FIR）测定  按BCECF-AM法4进行。取对数生长期的细胞，以1×106细胞重悬于1 ml PBS液中；加入不同浓度DMA，37孵育3

12、0分钟；加入BCECF-AM（终浓度1 g/ml），37孵育30分钟；PSS漂洗后置于LS-50B分光光度计上用双波长比例测量法检测，激发波长为495 nm和440 nm，发射波长为530 nm。FIR495 nm/440 nm。pHi标准曲线制作  参照文献4进行。细胞分别重悬于上述不同pH值氯化钾缓冲液中，加入BCECF-AM、Nigericin（终浓度5 mol/L）孵育30分钟，以pH值和对应FIR求出回归方程，作出pHi标准曲线。根据此曲线将检测FIR转换为相应的pHi值。细胞生长抑制率的MTT法检测取对数生长期细胞，用含10胎牛血清的RPMI 1640培养液调整细胞浓度为

13、1×105/ml，接种于96孔板，0.2 ml/well。同时分别加入不同浓度DMA，每种浓度设4个复孔，设置不加DMA的阴性对照孔和不加细胞的空白对照孔。常规培养48小时后加入MTT工作液20 l/well，孵育5小时，离心后弃上清，加入DMSO 0.15  ml/well，震荡10分钟使结晶充分溶解，酶标仪570 nm波长检测OD值，根据OD值计算相应抑制率。抑制率1（OD检测OD空白）/（OD阴性OD空白）细胞周期检测对数生长期细胞加入不同浓度DMA共同培养24小时，细胞悬液用70%的冷乙醇固定后，调整细胞浓度为106/ml；PI染色(50 g/ml)，4避光孵育30分钟，在流式细胞仪(美国FACS)上进行检测。原位细胞凋亡率检测对数生长期细胞分别与不同浓度DMA共同培养12、24、48小时，离心涂片机涂片；采用TUNEL法，封片后光镜高倍镜（×400）下观察，至少观察5个视野，计数200个细胞以上，计算阳性细胞百分率。统计分析细胞周期检测数据采用总体率假设检验。其余数据以均数±标准差（x±SD）表示，用Microsoft