组织型纤溶酶原激活因子对生物材料表面血小板黏附的体内和体外实验研究(1)

1、    组织型纤溶酶原激活因子对生物材料表面血小板黏附的体内和体外实验研究(1)    】 目的 本文观察组织型纤溶酶原激活因子（t-PA）包被Dacron和PTEE材料对表面血小板黏附的体内和体外实验。方法 通过体内和体外动物模型实验，观察血小板在材料表面的黏附情况和对机体内血小板黏附的影响。结果 通过t-PA处理后，上述两种材料表面的血小板黏附数目较对照组明显减少（P0.01），机体内血小板黏附也较空白组明显减少 （P0.01）。结论 t-PA可通过抑制血小板在材料表面的黏附，进而推断可以用于防治生物材料的细菌

2、黏附。组织型纤溶酶原激活因子（t-PA）具有特异的溶栓作用。        【关键词】 组织型纤溶酶原激活因子(t-PA)；包被Dacron；PTEE；表面血小板        近年来的很多研究表明Lin TL，Lu FM，Sheu MS. Antimicrobial coatings: A remedy for medical device-related infections. Med Dev Tech，2001，在由生物材料引发的

3、感染（biomaterial centered infection，BCI）中，45%的原因是因为生物材料与人体接触时，血液和组织中的纤维粘连蛋白（fibronectin）、玻璃粘连蛋白（vitronectin）和纤维蛋白原（fibrinogen）会吸附在材料表面，形成一层蛋白膜，而细菌很容易在这层蛋白膜上黏附，继而生长繁殖，逐渐形成一层顽固的水合多聚糖性质的生物活性膜（biofilm）1。这层生物膜可以吸收营养物质，具有一定厚度，产生很强的抗药能力，传统的抗菌治疗是无法根除的。根据细菌性感染的机理，本文就t-PA对生物材料表面血小板黏附的作用及影响进行初步探讨。  

4、60; 1 实验材料与方法         材料和仪器 涤纶（Dacron）B型（苏州华明织带有限公司），膨体聚四氟乙烯（PTEE，美国Gore&Associates公司）。谷胱苷肽硫基转移酶（Glutathione-S-trasferase，GST）和GST-t-PA融合蛋白由实验室制备，液体培养基（法国生物梅里埃公司）。         材料的包被 将Dacron和PTEE薄膜剪裁成96孔酶标板等大的原片，用蒸馏水

5、充分漂洗干净后在70%的酒精中浸泡30min，无菌条件下取出、晾干，置入96孔板中，每种材料分成3组，每孔分别加入100l含0.5mg/ml GST-t-PA的Tris-HCl缓冲液（pH8.0）或含0.5mg/ml GST的Tris-HCl缓冲液或单纯的Tris-HCl缓冲液，4放置过夜，弃去上清液，用Tris-HCl缓冲液（50mM Tris-HCl，pH8.0/120mM NaCl）轻轻漂洗两次移入新的96孔板孔中备用。         材料植入动物模型的制作 2.53.0kg雄性新西兰大耳白兔72只（武汉大

6、学医学院动物实验中心），随机分为3组(各组24只)：空白对照组，GST蛋白组和GST-t-PA蛋白组，每组又分为两组，D组（放置Dacron片）和PEET组(放置PEET片)。        动物称重后，2%戊巴比妥钠（35mg/kg）耳缘静脉麻醉动物，备皮消毒后沿股动脉走向切开皮肤，分离出两侧的股动脉和股静脉，结扎股动脉的侧枝循环，经股静脉注射肝素(10U/kg体重)，5min后从两端夹闭股动脉，其间间隔不小于6cm，用眼科剪剪开0.3cm左右的纵口，用生理盐水将血管内的血液冲洗干净，然后放入经GST蛋白或GST

7、-t-PA蛋白包被处理的两种涤纶材料膜片，空白组进行手术后血管缝合，不予以任何处理。用3-0聚丙烯线缝合血管，移去动脉夹使血流再通，密切观察手术处股动脉搏动情况。麻醉恢复后，正常饲养。于术后第2天，每组随机选8只行血小板沉积实验。     血小板在材料表面黏附的观察（体外实验） 取空白组新鲜兔动脉血，按91的比例与3.8%的枸橼酸钠溶液混匀，离心分离富含血小板的血浆，用PBS将血小板数目调节至106/ml，取150l加到上述处理的材料表面然后于37放置30min，弃取血浆，用PBS将材料膜片轻轻漂洗3遍后用2.5%的戊二醛固定2h，经冷冻干燥后进行扫描电

8、镜观察。随机选取6个视野进行血小板计数。         对机体内血小板黏附的观察（在体实验） 在植入物后2天，各组8只动物按前述方法麻醉，常规分离提取血小板，于血小板悬液内逐渐滴加Cr51铬酸钠溶液18.5MBq（0.5mCi）。将51Cr标记的血小板悬液2ml经股静脉注入体内，1h后取出移植材料，用PBS轻轻冲洗，并置于记数井中记数，同时抽取全血标本确定以确定游离和细胞51Cr活性，测定血小板计数和凝血酶原时间(PT)。       

9、0;2 结果         血小板在材料表面黏附的观察（体外实验） 结果显示，用t-PA重组蛋白及GST蛋白处理医用Dacron及PEEP片，可明显抑制血小板在其表面的粘附，对Dacron片，用GST包被使其表面的血小板数目比对照组减少了大约42.3%(P0.01)；而TFPI重组蛋白处理组的血小板粘附数目减少更为明显，与对照组相比减少了大约76.4%(P0.01)。在聚氯乙烯材料的实验中，也得到了类似的结果，其中GST处理的材料表面的血小板数目比对照组减少了大约34.1%(P0.05)；TFPI重组蛋白比对照组

10、则减少了大约74.8% (P0.01)。在两种材料的实验中GST组与TFPI重组蛋白组之间相比都有明显的差异(P0.05) (见图1)。    图1     在体实验中机体内血小板沉积的影响 在体实验研究表明，Dacron组中，GST-tPA组血管血小板沉积明显少于GST组和空白对照组载体组和空白对照组，（P0.05）；PEEP组也得出相同的结论。见表1。    表1 体内实验中不同材料的各组的血小板沉积的比较 注：和对照组相比，*P0.05；和对照组相比，*P0.01

11、60;       3 讨论        生物膜是一种黏附于非生物或生物表面的微生物菌落，它们包裹与它们自身产生的细胞外基质（EMC）中，是微生物的生长过程中为了适应生存环境而形成的一种与浮游细胞相对应的存在，而多数生物膜细胞的感染与生物医学材料（如导管、人工心瓣膜和置换关节等）的应用密切相关。生物材料植入感染是生物材料临床应用所面临的严重问题，极大地限制了生物材料的临床应用和推广。有统计分析生物材料中心感染（BCI）发病率有上升趋势，占美国医

12、院内感染的45%，死亡率为5%60%。人工血管移植和人工机械瓣膜置换术后感染发生率高达1%9%，死亡率3%60%。        根据细菌性感染的机理，目前人们通过2种方式进行抗菌：一是对材料表面改性，阻止细菌黏附在材料表面；二是依靠静电作用使菌体被吸附到带正电荷的材料表面，通过干扰细菌细胞膜的组成取得杀菌效果。体内植入材料表面激活了血小板。由于体内植入材料表面激活了血小板，血小板会介导细菌的黏附，因此，就有抗黏附性型抗菌材料应运而生，抗凝血性能好的生物材料可以阻止细菌的黏附。肝素是一种具有良好抗凝血作用的天然物质

13、，材料表面肝素化可以通过在界面局部肝素的释放而达到抗凝血作用。另外，纤维蛋白原吸附的减少、白蛋白吸附的增加，都可减少血小板的黏附和激活，达到阻止细菌黏附的效果。Bradley等2根据人体免疫学原理，在聚对苯二甲酸乙二醇脂材料表面涂覆一层白蛋白，通过抗菌试验，发现能够减少血小板的黏附和激活，从而非常有效的阻止了细菌的黏附。            【摘】目的本文观察组织型纤溶酶原激活因子（t-PA）包被Dacron和PTEE材料对表面血小板黏附的体内和体外实验。 

14、60;       本篇论文是由3COME文档频道的网友为您在网络上收集整理饼投稿至本站的，论文版权属原作者，请不用于商业用途或者抄袭，仅供参考学习之用，否者后果自负，如果此文侵犯您的合法权益，请联系我们。        研究发现，多种因素可以引起血管内皮细胞及单核细胞组织因子表达升高3，如组织的损伤、凝血酶、内毒素及细胞因子如IL-1(Interleukin-1)和肿瘤坏死因子(Tumoernecrosisfactor，TNF)等，而组织型纤溶酶原激活因

15、子t-PA是含有527个氨基酸的丝氨酸蛋白水解酶，具有特异的溶栓作用，是治疗以血栓形成为主病理变化的特效药4，5 。        当材料植入机体血管内时，由于组织损伤及白细胞的激活会引发血液中及血管内皮细胞表面及血液中单核细胞表面组织因子活性的升高，从而导致血液中及内皮细胞表面的血小板聚集及血栓的形成，从而细菌黏附及生物膜形成。由此可以预见，应用t-PA包被处理生物材料后，能在局部有效抑制组织因子凝血途径的启动、进而防止材料表面的血栓形成，对于防止生物膜形成和细菌黏附非常重。   &

16、#160;    本实验通过体内和体外实验研究表明，在GST-t-PA包被的材料进行体内生物材料实验，Cr51标记的血小板沉积明显少于对照组。其机制可能为：t-PA激活纤溶酶使纤维蛋白原和纤维蛋白溶解，并使血小板聚集溶解，血小板沉积减少，血小板释放细胞因子减少，如血小板源性生长因子和转化生长因子等，这些因子在移植血管的内膜增生中发挥关键作用6，从而抑制血管平滑肌细胞的增殖和迁徙，最终达到抑制生物膜形成的目的。至于其作用的机理及信号传导途径，有待进一步探讨。【参考文献】    1 Conarweron JW，Stew

17、art PS，Greenberg EP. Bacterial biofilms. A common cause of persistent infections. Science，1999，284：5418.    2 Tang L，Sheng Y. The mechanism of devicecentered infection. Thans Soc Biomater ，1998，24：7.    3 Lijuen HR，Collen D.Strategies for the improvement of thrombolytic sgents.Throb Haemost，1991，66:88-110.    4 Collen D，Lijnen HR. Thrombolytic agents. Thromb haemost，2005，93(4):627-630.    5 Frey JL. Recombinant tissue plasminogen activator (rtPA) for stroke. The perspective