脑室内注射胰岛素对大鼠全脑缺血后海马CA1区Bcl

1、脑室内注射胰岛素对大鼠全脑缺血后海马CA1区Bcl         08-01-12 11:46:00     编辑：studa20作者：李兵，章翔，蒋小帆，王彦刚，张戈  【关键词】  胰岛素；脑缺血；Bcl摘要：目的  观察胰岛素对全脑缺血后海马CA1区Bcl2 mRNA含量变化及其蛋白表达的影响，探讨胰岛素保护作用的机制。方法  利用4VO法制作大鼠全脑缺血模型。造成脑缺血15min后行再灌注 ，治疗组于再灌注后即刻经脑室注入1u

2、胰岛素(10L，1×105u/L)，缺血组则经脑室注入10L生理盐水。利用反转录PCR(RTPCR)、免疫组化及Westernblot法分别于全脑缺血后1、3、5d观察海马CA1区Bcl2蛋白表达及其mRNA相对含量的变化。结果  全脑缺血后1、3、5d治疗组海马CA1区可见呈阳性表达的Bcl2蛋白，而缺血组海马CA1区Bcl2蛋白的表达则呈阴性；Westernblot分析，全脑缺血后1、3、5d治疗组海马CA1区Bcl2蛋白电泳条带密度分别为2890.791±213.616，3147.396±243.561和2594.834±204.736，

3、明显高于缺血组的743.376±84.123，804.637±64.547和637.867±54.394(P<0.01)。全脑缺血后1、3、5d缺血组及胰岛素治疗组海马CA1区Bcl2 mRNA相对含量则未见明显差异。结论  全脑缺血后脑室内注入胰岛素可能通过促进海马CA1区神经元Bcl2基因的翻译途径从而促进Bcl2蛋白表达，这可能是其对全脑缺血后海马CA1区神经元产生中枢直接保护作用的主要机制之一 。关键词：胰岛素；脑缺血；Bcl2The effect of intraventricular administration of insulin

4、on expression of Bcl2 mRNA and protein in rat hippocampal CA1 region following global brain ischemiaABSTRACT: Objective  To investigate the mechanism of neuroprotective effect of insulin on hippocampal CA1 region, the relatively content of Bcl2 mRNA and the expression of Bcl2 protein in rat hip

5、pocampal CA1 region following global brain ischemia were observed. Methods  Fourvessel occlusion was used to establish the rat global brain ischemic model. After 15 minutes brain ischemia, 1 unit insulin (10L, 1×105u/L) was injected into the cerebral ventricular immediately post reperfusio

6、n in treated group, while, 10L NaCl (90g/L) solution was injected into the cerebral ventricular at the same time in ischemic group. The relatively content of Bcl2 mRNA and the expression of Bcl2 protein in hippocampal CA1 region had been detected by reverse transcription polymerase chain reaction (R

7、TPCR), immunocytochemistry, and Westernblot, respectively. Results  The expression of Bcl2 protein was negative in ischemic group and was positive in treated group, in 1, 3, 5 day post brain ischemia. While, Westernblotting analysis showed that the density of electrophoretic strip of Bcl2 prote

8、in was 2890.791±213.616, 3147.396±243.561 and 2594.834±204.736 in treated group. It was much higher than that in ischemic group, which was 743.376±84.123, 804.637±64.547 and 637.867±54.394, respectively. But, the relatively content of Bcl2 mRNA had no obvious difference

9、 between ischemic group and treated group. Conclusion  Intraventricular administration of insulin can improve the expression of Bcl2 protein by up regulating the translation of the Bcl2, and this may be the main point to achieve the neuroprotective effect on hippocamal CA1 region post global br

10、ain ischemia.KEY WORDS: insulin; brain ischemia; Bcl2自1978年首次在大鼠脑组织的提取物中发现有胰岛素及其受体以来，一些研究相继发现在其他哺乳动物及人类脑中也具有胰岛素及其受体的存在。胰岛素在中枢神经系统中的作用引起了广泛的注意。在缺血性脑损伤的研究过程中，人们通过动物实验发现，全脑缺血再灌注后使用胰岛素，可减轻神经元的死亡或脱失，且这种作用在使用葡萄糖抵销其降糖作用后并不减弱，表明胰岛素在全脑缺血再灌注过程中可不依赖其外周降血糖作用而发挥神经保护作用。但胰岛素对缺血性脑损伤产生中枢保护作用的详细机理目前仍不甚明了。近年来许多文献报道,脑缺

11、血后神经元的凋亡是缺血造成中枢神经系统损伤的一个重要原因。我们以往的研究证实，胰岛素对缺血性脑损伤具有中枢直接保护作用并可减少大鼠海马CA1区神经元的凋亡1。为进一步探讨胰岛素对缺血性脑损伤产生中枢直接保护作用的机理，我们对在脑缺血再灌注后，经脑室内注入胰岛素，对大鼠海马CA1区Bcl2mRNA相对含量变化及其蛋白表达的影响进行了观察。1  材料与方法1.1  实验动物及分组  采用健康成年雄性SD大鼠，共72只(清洁级)，体重(300±20)g，由第四军医大学动物实验中心提供。随机分为 缺血组：缺血再灌注后1、3、5d分别取材，每个时间点12只。胰岛素

12、治疗组：取材时间点及每个时间点的动物数同缺血组。1.2  动物模型制作  大鼠经20g/L戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔注射后，俯卧位固定于立体定向架上，于颈后正中第一、二颈椎处，切一长约1.5cm切口，剥离颈部肌肉显露第一颈椎上之双侧翼孔后，插入双极电凝镊，烧灼闭塞从中穿行的椎动脉，缝合伤口，置笼喂养。24h后，同法麻醉，于头顶部皮下插入针状电极，仰卧位固定。分离颈部肌肉，显露双侧颈总动脉，夹闭30s后描记脑电变化，以脑电变成直线为模型成功的标准。夹闭15min后放开动脉夹，行再灌注。于放开动脉夹后即刻，以前囟后1.2mm、中线旁开1.5mm为穿刺点。颅骨钻孔后，用微量

13、加样器垂直进针3.5mm穿刺脑室，缺血组注入10L生理盐水，治疗组注入1u (10L，1×105u/L)速效基因合成人胰岛素(丹麦诺和灵公司)。1.3  血糖测定  各组鼠分别于颈总动脉夹闭前及再灌注后30min、1、2、6、12、24h自鼠尾静脉取血约50L，用血糖测定仪(Lifescan)测定血糖。1.4  标本采集  于规定时间，麻醉后开胸显露心脏，自左心室插管至主动脉，剪开右心房，经预冷生理盐水冲净血液。每组每个时间点12只大鼠，其中4只以预冷之40g/L多聚甲醛灌注固定2h，断头取脑，前囟处以美兰标记，置40g/L多聚甲醛中固定4h，

14、系列脱水，石蜡包埋，冠状切片，收取前囟后3.8mm处相邻切片两张(6m)行免疫组化观察；4只断头取脑，剥离海马，切取双侧海马CA1区组织100mg，迅速置入液氮保存用于Westernblot检测。4只以焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的0.01mol/L PBS(4)50mL灌注，冲净血液，冰盒内断头取脑。快速剥离海马，切取双侧海马CA1区组织100mg，立即在干冰上冷冻，保存于-80冰箱。1.5  海马CA1区Bcl2 mRNA相对含量的测定1.5.1  总RNA提取  采用异硫氰酸胍法提取总RNA。获取的总RNA用分光光度计测量纯度及浓度后置-80保存备用。1.5

15、.2  反转录合成cDNA  在50L的反应体积中加入5g总RNA，10L 反应缓冲液，5L 10mol/L dNTPs，0.5L Rnasin(40u/L)，0.25g oligo(DT)12-18，4L 反转录酶(200u/L)，0.5L 0.1mol/L DTT，置37孵育1h，然后于65加热5min，储存于-30。引物设计及合成按照已报道2的Bcl2 cDNA设计其相应的特异性引物(引物序列5CACCCCTGGCACTTCTCCTTC3；5CACAATCCTCCCCCAGTTCACC3，扩增产物长度303bp)。大连宝生物公司合成。1.5.3  PCR扩增

16、  在25L的反应体积中加入合成的cDNA 0.1g，2.5L 10×PCR缓冲液，2.5L 2mol/L dNTPs，2.5L 25mol/L MgCl2，1L各引物(pmol/L)，0.5L Taq DNA聚合酶(5u/L)。使用PTC100 PCR仪进行热循环。循环条件：93 1min，56 30s，72 1min，进行一个循环；93 1min，56 30s，72 1min，进行32个循环；72 延伸8min。取扩增产物10L，经30g/L琼脂糖凝胶电泳、溴化乙锭染色后，用凝胶成像系统进行检测，用Labworks软件对各阳性条带的密度进行分析，计算各阳性条带的平均密度

17、值与actin条带平均密度值之比。1.6  Bcl2蛋白表达的观察  将获取的切片脱蜡至水，置入枸橼酸钠缓冲液(pH 6.0)行微波抗原修复10min；冲洗后滴加3%(体积分数)H2O2 阻断内源性酶15min，冲洗5min；滴加Bcl2抗体(Stanta Cruz，11000)50L，4孵育过夜，PBS冲洗，参照SABC试剂盒说明(博士德公司)分别滴加二抗及StreptavidinPeroxidase，DABH2O2混合液显色，封片，镜下观察。1.7  Westernblot1.7.1  蛋白提取及浓度测定  将收取的脑组织置提取缓冲液中制成

18、匀浆，4，15000r/min离心20min，收集上清，移入另一管中(浆蛋白)于溶解缓冲液中溶解沉淀，室温静置30min ，取上清移入另一管中(膜蛋白)，置于-70保存。用Bradford法测定蛋白含量。1.7.2  SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳  将蛋白样品与样品缓冲液混合(41)，每孔蛋白为50g，总体积20L；将样品加热至100×3min，旋转3s；将样品溶液加入加样孔，20mA恒流下电泳。1.7.3  Westernblotting  电泳后，将凝胶中的蛋白转至硝酸纤维素膜(NC)上，20g/L脱脂乳/TBS处理NC膜，室温下将NC膜置入含有Bcl2一抗(11000，含5g/L脱脂乳/TBS)孵育1-4h，TBST缓冲液洗10min×3次， 室温下，将NC膜分别置入含有二抗的稀释液中(酶标羊抗兔IgG， 15