白介素2抑制T细胞特异性免疫应答机制的研究

1、白介素2抑制T细胞特异性免疫应答机制的研究    作者：张腾龙,谢彦晖,王缨,林果为【摘要】  本研究查明白介素2（IL2）对静息T细胞抗原特异性免疫应答的作用，探讨IL2对静息T细胞中细胞因子信号传导抑制蛋白(suppressor of cytokine signaling 3，SOCS3 )表达的影响，及其与抗原特异性免疫应答的关系。用IL2（50 U/ml）预处理静息DO11.10 T细胞，洗涤去除IL2后用3HTdR掺入法检测静息DO11.10 T细胞针对OVA323-329抗原(ovalbumin，OVA，卵清蛋白)的特异性增殖；用I

2、L2（50 U/ml）刺激静息DO11.10 T细胞，然后用荧光实时定量PCR法检测SOCS3在刺激后不同时间的表达变化；用OVA323-329抗原活化静息DO11.10 T细胞，然后检测SOCS3在抗原活化后不同时间的表达变化。结果表明：静息DO11.10 T细胞经IL2刺激后抗原特异性增殖能力减弱；静息DO11.10 T细胞经IL2刺激后SOCS3表达上调，在刺激4小时后表达即明显上调，6小时后达到最高峰；静息DO11.10 T细胞经OVA323-329抗原活化后SOCS3表达明显下调，在活化后第2天降至最低，4天后基本恢复正常。结论： IL2在一定条件下可抑制静息T细胞抗原特异性免疫应答

3、，而且这种抑制作用可能与SOCS3表达上调有关。【关键词】  IL2；DO11.10 T细胞；SOCS3；OVA323-329抗原Abstract    The study was aimed to investigate the effect of IL2 on the acquired immune response of naive T cells，and to explore the influence of IL2 on  suppressor of cytokine signaling 3  (SOCS3) express

4、ion of naive T cells, as well as to elucidate the  role of SOCS3 on antigen specific immune response in vitro. Naive DO11.10 T cells were prestimulated with IL2 (50 U/ml), and stimulated with OVA323-329 antigen after removing IL2, then the proliferation of naive DO11.10 T cells was detected. Na

5、ive DO11.10 T cells were stimulated with IL2 (50 U/ml), and SOCS3 expression was detected by realtime PCR. Naive DO11.10 T cells were stimulated with OVA323-329 antigen, and SOCS3 expression was detected by means of 3HTdR. The results  showed that   after IL2 prestimulation, the proli

6、feration of naive DO11.10 T cells decreased significantly when stimulated with OVA323-329 antigen; SOCS3 expression of naive DO11.10 T cells was upregulated significantly after IL2 stimulation, the upregulation began obviously at 4 hours and reached peak at 6 hours. SOCS3 expression on naive DO11.10

7、 T cells was downregulated markedly after OVA323-329 antigen stimulation, the expression level  of SOCS3  was lowest on day 2 and returned to normal on day 4 after stimulation. It is concluded that  the antigen specific immune response of naive DO11.10 T cells is inhibited after prest

8、imulation with IL2,  which   may be mediated by SOCS3.Key words    IL2; DO11.10 T cell; SOCS3; OVA323-329 antigen白介素2（interleukin2, IL2）作为一种免疫增强制剂被广泛应用于肿瘤和艾滋病的临床治疗1，2，但只有大约20%的患者有治疗效果3，而且在某些治疗中应用IL2后反而产生免疫抑制的现象4，其具体机制尚不清楚。有研究发现，IL2除能扩大免疫反应外，还可诱导免疫耐受，认为这一作用可能与调节T细胞（Treg细

9、胞）有关5。另外还有研究发现，在一定条件下IL2刺激T细胞可以诱导细胞因子信号传导抑制蛋白(suppressor of cytokine signaling 3，SOCS3)表达上调6，而SOCS3是机体免疫应答的抑制因子7。因此，IL2可能通过诱导SOCS3的表达来抑制T细胞对抗原的应答。 为此， 我们以小鼠抗原特异性T细胞 （DO11. 10 T细胞）为研究对象，研究IL2对T细胞抗原特异性应答的影响，同时研究T细胞免疫应答与SOCS3变化的相关性。主要试剂与仪器TRIzoL购自北京鼎国生物公司，小鼠IL2为Sigma公司产品，realtime PCR Master Mix为Toyobo公

10、司产品，逆转录试剂与dNTP购自MBI公司，丝裂霉素为日本Kyowa公司产品，Taq DNA聚和酶购自Tiangen公司，所有引物均由上海生工生物公司合成。SN6904液体闪烁计数仪由上海原子核研究所日环仪器一厂生产，LightCyclerTM定量PCR仪为Roche公司产品，PE 240型PCR仪为Perkin Elmer公司产品。动物DO11.10 TCR转基因小鼠为卵清蛋白(Ovalbumin，OVA)抗原特异性小鼠，均为SPF级，雌性，6-8周龄，15-20 g，由中国科学院上海动物中心饲养。静息DO11.10 T细胞（naive DO11.10 T cell）的IL2预处理颈椎脱臼法

11、处死DO11.10 TCR转基因小鼠，用尼龙毛柱分离DO11.10 T细胞，以RPMI  1640培养液调整细胞浓度，铺入24孔板中，每孔1×107/2 ml，然后加入浓度为50 U/ml的IL26，于37、5 C02、饱和湿度培养箱中培养。SOCS3基因的检测总RNA提取与cDNA制备  用IL2预处理静息DO11.10 T细胞后每2小时裂解细胞（0、2、4、6、8、10、12小时），按照TRIzoL reagent操作说明抽提总RNA，溶解于10 l  DEPC水中。逆转录反应以OligodT为引物，操作按MBI试剂说明书进行。聚合酶链反应（PCR）

12、  此制备的cDNA为模板，操作按Taq DNA聚和酶操作说明进行，SOCS3引物上游序列为：5TGCGCCATGGTCACCCACAGC AAGTTT3，下游：5GCTCCTTAAAGTGGAGCA TCATACTGA3。荧光实时定量PCR（real timePCR）以上法制备的cDNA为模板，按realtime PCR Master Mix说明书进行操作，SOCS3引物上游为：5CAAGTCATCACTATTGGCAACGA3,下游：5CC CAAGAAGGAAGGCTGGA3。actin引物上游:5CCAGCCATGTACGTTGCTATC3,下游: 5CA GGTCCAGAC

13、GCAGGATGGC3。DO11.10 T细胞抗原特异性增殖实验首先将分离的静息T细胞在含有IL2（50 U/ml）的RPMI 1640培养液中预处理6小时，洗涤去除IL2后加入96孔板中（1×105/well）。以丝裂霉素（100 g/ml）灭活的DO11.10 TCR转基因小鼠脾细胞作抗原呈递细胞（4×105/well）。OVA323-329特异性抗原终浓度为0.6 mol/L。37、5 CO2培养5天，终止培养前18小时加3HTdR (0.5 Ciwell)，用液闪计数仪测cpm值。本实验设3个复孔，设未经IL2预处理的静息DO11.10 T细胞组为对照组。统计学分析

14、采用SPSS 13.0软件处理，用单因素方差分析（oneway ANOVA）统计方法分析数据，P<0.01为有统计学意义。结    果IL2体外抑制静息T细胞抗原特异性增殖IL2的所有作用都是通过与IL2受体（IL2R）结合来实现的。免疫应答中，T细胞经抗原活化后高表达CD25（IL2R亚基）,此时IL2作用于T细胞，能够与CD25结合促进T细胞增殖，增强免疫反应。而T细胞未接受抗原活化前（静息T细胞）基本不表达CD255，因此用IL2刺激静息T细胞并不会促其增殖，但IL2对静息T细胞的影响尚不清楚。本研究以DO11.10转基因小鼠静息T细胞（静息DO11.

15、10 T细胞，为OVA抗原特异性T细胞）作为研究对象。静息DO11.10 T细胞经尼龙毛柱法分离后用FACS鉴定纯度可达90以上，在接受抗原特异性活化之前先用IL2预处理6小时，然后再用OVA323-329抗原刺激，最后用3HTdR掺入法检测其针对OVA323-329抗原的特异性增殖。结果发现，经IL2预处理6小时的静息DO11.10 T细胞的抗原特异性增殖较之正常对照组（静息DO11.10 T细胞未经IL2预处理组）明显下降（P<0.01）（图1）。IL2预处理静息T细胞可以诱导SOCS3表达上调由前面得知，IL2预处理静息DO11.10 T细胞可以抑制其抗原特异性增殖，而未经IL2预

16、处理的静息DO11.10 T细胞的抗原特异性增殖未受抑制，导致这种差异的原因就在于T细胞在接受OVA323-329抗原刺激前是否经过IL2的预处理。Cohney等6研究发现，IL2刺激T细胞可以诱导JAK/STAT信号传导通路的反馈抑制分子（SOCS3）蛋白的表达上调，因此我们进一步检测在IL2预处理的过程中是否伴有SOCS3表达水平的变化。realtime PCR法检测结果发现，在IL2预处理静息DO11.10 T细胞的过程中SOCS3的表达水平明显改变（图2）。在静息T细胞经抗原活化后SOCS3表达下调由前面得知，IL2预处理静息DO11.10 T细胞可以抑制其抗原特异性增殖，同时伴有SO

17、CS3表达上调，因此我们进一步探讨其具体作用机制，研究SOCS3在T细胞免疫应答中发挥着怎样的作用。我们用OVA323-329抗原活化静息DO11.10 T细胞，研究在正常免疫应答状态下抗原特异性活化对T细胞SOCS3表达的影响。结果发现，DO11.10 T细胞经OVA323-329抗原活化后SOCS3表达水平明显下调（图3），在OVA323-329抗原活化后第1天即有明显的下调，活化后第2天降至最低，第3天开始逐渐升高直至第4天基本正常。由于SOCS3在免疫应答中发挥着重要的负向调节作用8，因此抗原活化后SOCS3的短暂下调与机体的免疫防御有关，有利于免疫应答的迅速启动，清除“异物”威胁，在

18、抗原活化后期恢复正常则与免疫自稳有关，可以防止免疫过度扩大造成损伤9。因此IL2预处理静息DO11.10 T细胞可以诱导SOCS3表达上调，使该T细胞在随后的免疫应答中不能将SOCS3下调至不影响免疫应答启动的水平，导致免疫应答正常启动受到影响，最终抑制该T细胞抗原特异性免疫应答。讨    论IL2是一种具有多种生物学活性的细胞因子，是增强机体细胞免疫的重要介质，目前被广泛应用于肿瘤和艾滋病的临床治疗1，2，但近来发现其治疗效果并不如理论推测的那样高。在一项283例的转移性黑色素瘤和肾细胞癌的临床研究中发现IL2的治疗有效率只有15%-20%，其中长期有效率只有7

19、%3，而且在艾滋病的治疗中部分患者应用IL2后反而产生免疫抑制的现象4。另外，IL2对移植物抗宿主病（GVHD）的影响是加重还是抑制一直存在争议，目前普遍认为，IL2对GVHD主要起促进作用，但有些研究也发现IL2在一定条件下具有抑制GVHD的作用10，11，具体机制尚不清楚。IL2的功能具有多样性, 不仅能够促进T细胞增殖和参与T细胞凋亡，而且还具有抑制免疫的作用，有研究认为可能与Treg细胞有关5，12。本研究发现，IL2在一定浓度下可以抑制T细胞抗原特异性免疫应答，其机理可能部分与诱导SOCS3表达上调有关，目前还未见文献报道。Yu等9曾用转染方法使D10.G4.1 Th2 细胞高表达S

20、OCS3，发现该细胞抗原特异性免疫应答明显受抑。本研究用IL2诱导的方法使静息DO11.10 T细胞SOCS3表达上调，发现该细胞的抗原特异性免疫应答也明显减弱。因此，我们认为IL2抑制抗原特异性免疫应答的作用机理可能部分与诱导SOCS3的表达上调有关。SOCS3是JAK/STAT信号传导通路的抑制因子，可以通过抑制JAK激酶活性和STAT磷酸化两种机制抑制细胞因子信号传导,阻止T细胞的免疫扩大，产生免疫抑制作用13。因此，IL2在一定浓度下的抑制免疫作用可能与诱导SOCS3表达上调有关，这一结果不仅有助于我们理解IL2功能的多样性，还有助于解释IL2在临床治疗时出现的免疫抑制现象。IL2的临

21、床治疗效果可能在很大程度上与机体的免疫应答状态有关。如果应用IL2的时候体内T细胞已被抗原活化，由于活化T细胞高表达CD25，因此IL2与IL2R亲和力明显增强，激活JAK/STAT信号传导通路，同时T细胞经抗原活化后SOCS3表达下调（图3），使SOCS3对JAK/STAT通路的抑制作用减弱，最终STAT发生磷酸化进入胞核内，激活基因转录，扩大免疫反应。体内未接受抗原活化的静息细胞不表达CD25，当应用外源IL2时，IL2与IL2R亲合力低，JAK/STAT通路的细胞因子结合信号很弱，这时IL2可诱导负反馈调节因子SOCS3的表达上调（图2），使JAK/STAT通路的信号转导进一步受抑，最终

22、抑制STAT转录因子进入胞核内，抑制免疫反应，此时临床用IL2治疗肿瘤及艾滋病表现为无效甚至产生抑制免疫的现象。IL2在一定浓度下抑制免疫的作用与其上调SOCS3表达有关这一点具有重要的临床意义，为IL2的临床治疗应用提供参考作用。如果应用IL2治疗时机体免疫细胞处于激活状态，必会扩大免疫应答；而如果应用IL2治疗时机体免疫细胞处于无能或未活化状态，则很可能出现抑制免疫的现象，这也提示我们并非各种肿瘤疾病的各个时期都适合用IL2进行治疗，具体运用的机制等还需进一步研究解决。尽管IL2的作用机制已有较多研究，但仍存有许多疑点和争议，了解其功能的多样性，阐明其具体作用机制及调节作用，这可能是今后研

23、究的重点，而研究的不断进步也必将为其在临床治疗的应用发展提供新的思路。【参考文献】1Atkins MB. Interleukin2: clinical applications. Semin Oncol, 2002; 29（Suppl 7）:12-172Kovacs JA, Vogel S, Albert JM, et al. Controlled trial of interleukin2 infusions in patients infected with the human immunodeficiency virus. N Engl J Med, 1996; 335:1350-135

24、63Rosenberg SA, Yang JC, Topalian SL, et al. Treatment of 283 consecutive patients with metastatic melanoma or renal cell cancer using highdose bolus interleukin 2. JAMA, 1994; 271:907-9134Sereti I, Anthony KB, MartinezWilson H, et al. IL2 induced CD4+ Tcell expansion in HIV infected patients is ass

25、ociated with longterm decreases in Tcell proliferation. Blood, 2004; 104:775-7805Malek TR, Bayer AL.Tolerance, not immunity, crucially depends on IL2. Nat Rev Immunol, 2004; 4:665-6746Cohney SJ, Sanden D, Cacalano NA, et al. SOCS3 Is tyrosine phosphorylated in response to interleukin2 and suppresses STAT5 phosphorylation and lymphocyte proliferation. Mol Cell Biol, 1999, 19:4980-49887Alexander WS. Suppressors of cytokine signaling (SOCS) in the immune system. Nat Rev Immunol, 2002; 2:410-4168Jo D, Liu D, Yao S, et al. Intracellular protein therapy with SOCS3 inhibits inflammation and