穿心莲内酯联合5-FU对人胃癌BGC-823细胞的体内外抑制作用

1、穿心莲内酯联合5-FU对人胃癌BGC-823细胞的体内外抑制作用    基金项目:浙江省中医药管理局资助项目(2009CB029) 作者简介:杨琼(1983-), 女 ,浙江杭州人,医师,硕士,主要从事消化道肿瘤的研究。 通讯作者:李曙光(1965-),男 ,浙江杭州人,主任医师,博士,主要从事消化道肿瘤的研究。 摘 要: 目的:探讨穿心莲内酯联合5-Fu对人低分化胃癌细胞株BGC-823的协同抗肿瘤作用。 方法:以人胃癌BGC-823细胞株为靶细胞,通过体外细胞培养和裸鼠移植瘤试验,采用 MTT法检测、绘制效应-合用指数曲线、抑瘤率计算等方法。 结果:

2、穿心莲内酯在7.5120g/mL、5-FU在3.7560g/mL范围内均能抑制BGC-823细胞的生长,具有剂量-效应关系和时间-效应关系。两药联合作用24h、48h、72h时的中效抑制浓度分别为17.32、9.54、4.11g/mL,显著小于单药应用组。72h效应-合用指数曲线表明两药在抑制效应0.97范围内可产生协同作用。穿心莲内酯联合5-FU对人BGC-823细胞裸鼠移植瘤的抑瘤率为(75.51±12.57)%,与单药组相比差异均有显著性。结论:穿心莲内酯、5-Fu能在体内外抑制人胃癌BGC-823细胞的生长,两药联合产生协同或相加作用。 ? 关键词:穿心莲内酯; 5-氟尿嘧啶

3、; 胃肿瘤; BGC-823细胞; 移植瘤? 文献标识码:A文章编号: 1673-7717(2010)04 -0887 -04 Synergistic Effect of Andrographolide and 5-fluorouracil on the Inhibition of BGC-823 Cell line of Human Gastric Cancer YANG Qiong,YE Zai?yuan,LI Shu?guang,MA Wen?dong (Zhejiang People's Hospital, Hangzhou 310014,Zhejiang,China) ? A

4、bstract:Objective:To study the anti-proliferation effects of the Andrographolide with the 5-fluorouracil(5-Fu) on BGC-823 cell line of human gastric carcinoma. Methods:MTT assay were applied to determine cell inhibition in vitro. Median inhibitory concentrations (IC50 ) of andrographolide with 5-FU

5、or used alone were calculated; Tumor inhibition rate of xenografts in nude mice were measured in vivo. Results:Andrographolide at the dose of 7.5120g/mL and 5-Fu at the dose of 3.7560g/mL can both inhibit the proliferation of BGC-823 cells with a concentration and time dependent manner. The cell inh

6、ibition rates and xenografts inhibition rates (75.51±12.57)% was obviously increased when the two agents were combined used. Median inhibitory concentration (ic50)of andrographolide with 5-FU at the time of 24h, 48h, 72h were17.32,9.54,4.11g/mL respectively, which were significantly lower than

7、single groups. The curve of combination index-effect relationship indicated a synergistic effect produce by andrographolide and 5-FU when the response rate was lower than 97%. Conclusion:Andrographolide and 5-Fu can inhibit the growth of BGC-823 cell line in vitro and in vivo. Combination use of the

8、 two drugs will play a synergistic effect in the activity of anti-gastric cancer.? Key words:andrographolide; 5-fluorouracil; gastric carcinoma; BGC-823 cell line 穿心莲内酯(Andrographolide)为爵床科植物穿心莲中提取的二萜内酯类化合物,是中药穿心莲的主要有效成分之一。具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗肿瘤、免疫调节、治疗心脑血管疾病、保肝利胆等作用1-2。现代研究证明穿心莲内酯对乳腺癌MCF-7细胞、食管癌Ec9706细胞、前

9、列腺癌PC-3等多肿瘤细胞具有明确的抑制作用3-6。目前,国内外有关穿心莲内酯对胃癌作用的研究很少,且鲜有与其它化疗药物联合治疗的报道。本研究以人胃癌BGC-823细胞株为靶细胞,通过体外细胞培养和裸鼠移植瘤试验,采用 MTT检测、观察抑瘤率等方法探讨穿心莲内酯与5-Fu联合治疗对人低分化胃癌BGC-823细胞的体内外抗肿瘤作用,为寻找低毒增效的胃癌化疗新方案提供理论依据。 1 材料与方法 1.1 肿瘤细胞株及培养条件? BGC-823人低分化胃癌细胞,由上海交通大学消化外科实验中心惠赠。在含100/mL青霉素、100/mL链霉素、10%胎牛血清的完全RPMI-1640培养液中,37、5% C

10、O?2条件下培养,12天更换培养液1次。 1.2 实验动物? BALB/C裸鼠,体重1820g,6周龄,雌性。购自上海斯莱克实验动物中心,动物合格证号:SCXK(沪)2003-003,于浙江中医药大学SPF级实验动物中心饲养。 1.3 实验药物及试剂? 穿心莲内脂Andrographolide(纯度大于98%)由中国药品生物制品检定所生产。用二甲亚砜(DMSO)溶解,配制成100g/mL的储备液,-20保存;5-氟脲嘧啶(5-FU)由天津金耀氨基酸有限公司生产,规格250mg/10mL;RPMI-1640培养液;胎牛血清;胰酶;噻唑蓝(MTT,美国Genview)。 1.4 实验方法 1.4.

11、1 MTT法 取指数生长期的 BGC-823细胞,以2.5×10?5/mL细胞浓度接种于96孔培养板,200L/孔。待12h细胞贴壁良好后,加入待测药物培养基200L/孔,穿心莲内酯组终浓度分别为7.5、15、30、60、120g/mL, 5-Fu组终浓度分别为3.75、7.5、15、30、60g/mL,穿心莲内酯 5-Fu联合组的终浓度分别为7.5 3.75、15 7.5、30 15、60 30、120 60g/mL。阴性对照组只加等量的培养液,空白对照无细胞生长,只加试剂。每个剂量设3个平行孔。于24h、48h、72h各取一块96孔培养板,每孔加5mg/mL的MTT 20L。自动

12、酶标仪于 570nm波长处测各孔吸光度值(OD值)。以上实验重复4次。细胞抑制率(%)=(l-给药孔OD值/对照孔OD值)×100%。回归方程计算中效浓度(IC50):即抑瘤率为50%时的药物浓度。计算合用指数(CI)的,结果判断:CI        1.4.2 人胃癌皮下裸鼠移植瘤模型的建立 取对数生长期的BGC-823细胞,胰酶消化,用PBS洗2次,调整细胞悬液浓度为1×107个/mL。于BALB/C裸鼠右腋下接种移植瘤,每只裸鼠接种1×106个细胞(0.1mL),共接种70只。1

13、周后,肿瘤体积约6070mm3左右,共52只成瘤。 1.4.3 体内抗肿瘤药敏实验 动物分组及药物干预:选出肿瘤大小相对均匀一致的48只,按瘤体大小先分两层,再随机进行分组,每组8只,共6组。穿心莲内酯研成粉末,溶于生理盐水成悬浊液,配成穿心莲内酯低剂量100mg/(kg #8226;d)(2mg/只)、穿心莲内酯中剂量200mg/(kg #8226;d)(4mg/只)、穿心莲内酯高剂量400mg/(kg #8226;d)(8mg/只)和穿心莲 5FU浓度组100mg/(kg #8226;d) 5mg/(kg #8226;d)。另设阴性对照组生理盐水灌胃,0.1mL/(只 #8226;d)和阳

14、性对照组20mg/(kg #8226;d)(0.4mg/只),隔日给药1次,穿心莲内酯予灌胃,5-FU予腹腔注射,各组均给药14天。? 小鼠生存状态的观察:给药期间每天观察各组裸鼠的精神、饮食、活动、大小便等一般情况,以及死亡情况。用游标卡尺测量瘤体大小,每4天1次。? 用药14天后,电子天平称取瘤重,并按下面公式计算抑瘤率:抑瘤率(%)=(1-实验组平均瘤重/阴性对照组平均瘤重)×100%。 1.5 统计学处理? 采用SPSS 13.0软件包统计。MTT结果以±s表示,组间比较采用单因素方差分析进行处理。P2 结 果 2.1 穿心莲内酯与5-Fu联合对人胃癌BGC-823

15、细胞增殖的影响? 不同浓度的穿心莲内酯、5-FU和联合组作用不同时间后对BGC-823细胞均产生抑制作用,且随药物浓度的增加,作用时间的延长,细胞增殖速度减慢,呈剂量-效应关系和时间-效应关系。相关回归分析可知24,48,72h的半数抑制浓度穿心莲组分别为21.58、 28.42、34.16g/mL,5-Fu组为56.76、27.50、15.72g/mL,联合组为17.32(5.77 11.55)、9.54(3.18 6.36)、4.11(1.37 2.74)g/mL。穿心莲与5-Fu单用时72h的中效浓度分别为两药合用时中效浓度的8.31倍和3.82倍,可以间接地反应出联合用药的优势。? B

16、W(D(Y,1,2)MD2 WT5”FZ中华中医药学刊 BW(S(Z,1,)MD2WT5”FZ中华中医 药学刊 表1穿心莲内酯对BGC-823细胞增殖抑制的影响 ANDRO(g/mL)24h 吸光度值A(±s)抑制率IR(%) 48h 吸光度值A(±s)抑制率IR(%) 72h 吸光度值A(±s)抑制率IR(%) 00.417±0.0230ab0.558±0.0320?b0.659±0.0770?b 7.50.379±0.0339?b0.529±0.0305ab0.628±0.0755ab 150.307

17、±0.04726ab0.396±0.08129?b0.456±0.07730ab 300.222±0.04747ab0.289±0.03548ab0.129±0.08580?b 600.142±0.02766?a0.121±0.02878?a0.083±0.08987?a 1200.059±0.017860.017±0.084970.018±0.07997 注:与后面第1组比较,a PP表25-FU对BGC-823细胞的抑制作用 5-FU(g/mL)24h 吸光度值A(

18、77;s)抑制率IR(%) 48h 吸光度值A(±s)抑制率IR(%) 72h 吸光度值A(±s)抑制率IR(%) 00.417±0.0230ab0.558±0.0320ab0.659±0.0770ab 3.750.376±0.01610?b0.347±0.03038?a0.320±0.02751?b 7.50.328±0.07121?b0.316±0.03443?b0.295±0.02155?b 150.287±0.01331?b0.286±0.04749?b0.

19、199±0.03070?b 300.259±0.022380.139±0.025750.038±0.02794 600.206±0.036500.074±0.036860.026±0.08596 注:与后面第1组比较,a PP表3穿心莲内酯 5-FU联合作用 对BGC-823细胞的抑制作用(?±s?) 5-FU(g/mL)24h 吸光度值A抑制率IR(%) 48h 吸光度值A抑制率IR(%) 72h 吸光度值A抑制率IR(%) 00.417±0.0230ab0.558±0.0320ab0.659

20、±0.0770ab 11.250.290±0.01939?b0.259±0.05854ab0.170±0.03874?b 22.50.183±0.03256ab0.157±0.09172ab0.075±0.02489?b 450.106±0.04575ab0.059±0.05590?b0.018±0.04297 900.042±0.016900.021±0.018960.011±0.09698 1800.027±0.013940.017±0.01

21、8970.010±0.07799 注:与后面第1组比较,a PP表4穿心莲内酯 5-FU作用于BGC-823细胞 72h的回归方程及中效浓度 组别回归方程中效浓度(g/mL)相关系数(R) Andro组y=2.999x-4.001334.160.696 5-FU组y=2.953x-3.43315.720.621 Andro 5-FU组y=1.599x-0.9814.1120.313        表5 穿心莲内酯 5-FU作用于BGC-823细胞 72h在不同效应时的合用指数 效应(fa)0.10 0.2

22、0 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0.90 0.95 0.96 0.97 0.98 合用指数(CI)0.09 0.13 0.16 0.19 0.23 0.27 0.33 0.41 0.56 0.74 0.80 0.89 1.01 2.2 穿心莲内酯的体内抑瘤作用 2.2.1 裸鼠的一般情况 实验用药后联合组、各剂量穿心莲组及生理盐水组裸鼠精神状态均良好,活动正常,反应敏捷,进食、饮水正常,皮肤颜色如常,大小便正常,5-FU组裸鼠用药后精神逐渐萎靡不振,活动减少,反应迟钝,不同程度进食下降,并于用药后7天后陆续出现血性腹泻,消瘦。实验过程中,阴性对照组、5-FU阳性

23、对照组、低剂量组各有1只死亡,穿心莲内酯中高剂量组和联合组无死亡。 图1穿心莲内酯作用于BGC-823细胞 24h 48h 72h后的浓度-效应曲线 图25-FU作用于BGC-823细胞 24h 48h 72h后的浓度-效应曲线 图3穿心莲内酯与5-FU作用于BGC-823细胞 24h 48h 72h后的浓度-效应曲线 图4 穿心莲内酯与5-FU联合作用于 BGC-823细胞的效应-合用指数曲线 2.2.2 瘤重的比较 阴性对照、穿心莲低、中、高剂量组、5-FU组、穿心莲 5-FU联合组的瘤重依次降低,与阴性对照组相比,差异均有统计学意义(P0.05)。 2.2.3 抑瘤率的比较 阳性对照组及

24、穿心莲内酯高、中、低剂量组小鼠肿瘤的生长均明显受到抑制。穿心莲内酯低剂量、中剂量和高剂量组的抑瘤率分别为22.2 %、44.7%和57.8 %。随着剂量增加,抑瘤率逐渐增高(P0.05)。5-Fu与穿心莲联合作用时抑瘤率为75.51%,与穿心莲高剂量和阳性组相比均有显著差异(P表6BGC-823细胞裸鼠移植 瘤重量及肿瘤抑制率(±s) 组 别n瘤 重(g)肿瘤抑制率(%) 阴性对照组71.67±0.40?b0?b 低剂量组71.30±0.15ab22.23±8.76ab 中剂量组80.92±0.14ab44.65±8.39ab 高剂量

25、组80.70±0.22?a57.84±13.09?a 5-FU对照组70.65±0.21?b60.70±12.74?b 联合组80.41±0.21?a75.51±12.57?a 注:与相邻前一组比较,aP<0.05;与相邻后一组比较,bP3讨 论? 穿心莲 Nees又称穿心莲乙素,为爵床科植物穿心莲干燥的地上部分。味苦,性寒。归心、肺、大肠、膀胱经,具有清热解毒、凉血消肿之功效。从中药穿心莲叶、茎中分离得到的二萜类化合物穿心莲内酯是其主要活性成分,体内毒性很小,口服易吸收。在人体1.52h血药浓度达高峰,10h仍有残留,72h

26、90%都被排除。? 穿心莲内酯具有显著的抗癌作用,且浓度范围因肿瘤细胞的种类不用而有所差异。当穿心莲内酯浓度达到2030M以上时,可对多种肿瘤细胞株等的生长产生抑制作用。其作用机理包括:(1)诱导肿瘤细胞凋亡;(2)抑制细胞周期G?0-G?1期和某些癌基因的表达;(3)提高淋巴细胞抗肿瘤活性;(4)抑制血管生成;(5)抑制作用靶点的活性,而抑制了癌细胞的浸润和黏附;(6)与抗癌药产生协同作用,提高药物疗效,降低耐药性等2-6。? Cheung7报道穿心莲内酯可阻滞细胞周期于G?0/G?1期,启动线粒体途径而诱导人急性早幼粒白血病细胞系(HL-60)凋亡;作用于黑色素瘤及结肠癌HT-29肿瘤细胞

27、系,可诱导周期抑制蛋白P27和降低CDK4的表达,使细胞停滞于G?0/G?1期,而抑制其增殖8。此外,穿心莲内酯还是一种具有调节机体非特异免疫功能的免疫刺激剂9,能促进T淋巴细胞转化、刺激NK细胞活化、降低外周血sIL-2R水平、而发挥免疫调节和免疫细胞的杀瘤作用。徐立春等10将莲必治单体与人恶性黑色素瘤浸润淋巴细胞(简称人恶黑TIL)并用,观察其对BLAB/c裸鼠体内抗人恶性黑色素瘤肺转移、皮下肿瘤结节形成及荷瘤裸鼠生存时间的影响。结果表明,LBZ能抑制人恶黑荷瘤裸鼠皮下肿瘤结节形成,与生物制剂(TIL、IL2)联用,生存时间延长更明显,抗肿瘤作用呈生物放大效应。? 近年来有研究将穿心莲内酯

28、与传统化疗药物如5-FU、顺铂、阿霉素、环磷酰胺等联合作用于癌细胞或其移植瘤,结果产生了较单独用药更为强烈的抗肿瘤作用。5-FU作为一种抗代谢药物11,40余年来,一直是胃肠道肿瘤化疗的首选和基本用药。它能抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶,从而阻断脱氧尿苷酸转变为脱氧胸苷酸,使DNA合成障碍而导致细胞损伤和死亡。5-FU对细胞增殖各期都有毒性作用,但主要是S期。近几年来,5-FU老药新用,开拓新衍化药等使得胃癌联合化疗中含5-FU类者占76%。? 本研究将穿心莲内酯与5-Fu联合作用于人胃癌BGC-823细胞,体内外实验证明穿心莲内酯能有效抑制人胃癌BGC823细胞的生长,且呈明显的时间和剂量依赖性。

29、穿心莲内酯与5-FU并用时,抗肿瘤效果更为显著,表明两者在一定浓度范围内可发挥协同或相加效应,即达到同样的药物效应时所需浓度较小。这样既有助于增加疗效,也减轻了化疗药物的毒副反应,延缓了耐药性的发生。因此穿心莲内酯与5-FU可能成为一种联合化疗方案应用于胃癌的治疗,具有进一步研究的价值。        参考文献 1 Ji LL,Wang Z,Dong F,et al. Andrograpanin, a compound isolated from anti-inflammatory traditional Chin

30、ese medicine Andrographis paniculata, enhances chemokine SDF-1alpha-induced leukocytes chemotaxisJ. J Cell Biochem, 2005,95(5):970-978. 2 Jada SR, Subur GS, Matthews C. Semisynthesis and in vitro anticancer activities of andrographolide analoguesJ. Phytochemistry,2007, 68(6):904-912. 3 Hidalgo MA, R

31、omero A, Figueroa J, et al. Andrographolide interferes with binding of nuclear factor kappa B to DNA in HL-60 derived neutrophilic cellJ. Br J Pharmacol, 2005, 144(5): 680-686. 4 Hwei-Ru Tsai, Li-Ming Yang, Wei-Jern Tsai, et al. Andrographolide acts through inhibition of ERK1/2 and Akt phosphorylation to suppress chemotactic