氧化修饰高、低密度脂蛋白对胆固醇合成及逆转运基因SREBP-2和ABCA1表达的影响

1、氧化修饰高、低密度脂蛋白对胆固醇合成及逆转运基因SREBP-2和ABCA1表达的影响    动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是一种严重影响人类健康的疾病,冠状动脉粥样硬化性心脏病是其中危害最大的一种,特别是随着我国老龄社会的到来,在我国冠心病(Coronary heart disease,CHD)的发病率和患病率日益增加。冠心病为多因素疾病,即多种因素作用于冠心病发病的不同环节所致。冠心病的主要危险因素大体上可以分为不可改变因素(如性别、年龄、冠心病家族史等)和可改变因素或者环境因素(如血脂异常、高血压、吸烟、糖尿病和糖耐量异常),还

2、有肥胖、少体力活动、A型性格、感染等。其中血脂异常特别是高胆固醇已是公认的危险因素。胆固醇是生物体内一种重要的脂类物质,它一方面是生物膜的基本成分之一,另一方面又是胆汁酸、类固醇激素等多种生理活性物质的原料。然而胆固醇浓度异常增高及其功能状态的改变都可以导致增加动脉粥样硬化和心脏病的危险,因此机体内胆固醇的浓度及正常生物活性应受到严格调控,以保证其正常生物功能发挥。大量研究表明,动脉粥样硬化的发生、发展与低密度脂蛋白(low densitylipoprotein,LDL)受到氧化修饰有关。天然的LDL中含有大量不饱和脂肪酸,容易发生自身氧化,形成氧化低密度脂蛋白(oxidized LDL,ox

3、-LDL)。近年来大量研究认为,LDL促进动脉粥样硬化的发生发展主要通过ox-LDL的作用得以实现。固醇调节元件结合蛋白-2(Sterol regulatory element binding proteins2,SREBP-2)是重要的核转录因子之一,它能与脂质合酶基因的启动子/增强子的固醇调节元件结合,激活靶基因转录,特异性调控胆固醇摄入及合成代谢。体内脂质代谢特别是胆固醇的稳态依赖于SREBP-2的调节。SREBP-2基因表达异常可导致这种调节平衡失调时,细胞内胆固醇就会大量沉积,最终导致泡沫细胞的形成。目前研究尚无明确的关于氧化型脂蛋白对单核源性巨噬细胞中SREBP-2表达影响的研究,

4、探讨氧化型脂蛋白对巨噬细胞中胆固醇合成调节基因SREBP-2表达的作用有利于阐明其致动脉粥样硬化的机制。本研究从氧化型脂蛋白(主要是ox-HDL和ox-LDL)对SREBP-2影响角度进行研究,以了解氧化型脂蛋白调控巨噬细胞SREBP-2表达在致动脉粥样硬化过程中的作用。胆固醇的另一组分,高密度脂蛋白胆固醇亦会被氧化修饰成氧化型高密度脂蛋白(oxidized HDL,ox-HDL),当其成为ox-HDL后即和ox-LDL一样具有较强的致动脉粥样硬化作用,而失去其抗动脉粥样硬化的保护作用。目前研究表明高密度脂蛋白对心血管系统具有保护作用,这种保护作用是通过细胞逆胆固醇转运(Reverse Cho

5、lesterol Transport,RCT)机制来实现的,腺苷三磷酸结合盒转运体Al(ATP binding cassette transporter Al,ABCA1)是升高HDL-C及增加逆胆固醇转运的关键基因,ABCA1在逆胆固醇转运过程中把胆固醇成分逆转运给HDL-C,再通过HDL-C组装后经血液循环到肝脏中代谢排除。由此可见,HDL和ABCA1在胆固醇逆转运中起着关键性作用。已有研究表明,当HDL被氧化修饰后则失去了这种正常生物学保护作用,且ox-HDL具有导致动脉粥样硬化的作用。本研究就试图通过建立冠心病患者外周血来源巨噬细胞模型,然后给予不同浓度ox-HDL和ox-LDL干预,

6、RT-QPCR检测巨噬细胞模型ABCA1mRNA表达变化,以初步探讨ox-HDL和ox-LDL调控巨噬细胞ABCA1表达在致动脉粥样硬化过程中的作用。目的拟通过建立冠心病外周血单核细胞来源巨噬细胞模型,予以不同浓度的ox-LDL和ox-HDL进行干预,观察不同浓度ox-LDL和ox-HDL影响下巨噬细胞中SREBP-2及ABCA1表达的改变,以探讨ox-LDL和ox-HDL在冠心病发生发展中与SREBP-2和ABCA1表达变化关系。对象与方法1、对象根据中华医学会2007年公布的不稳定性心绞痛和非ST段抬高心肌梗死诊断与治疗指南及2004年ACC/AHA公布的ST段抬高心肌梗死诊断和治疗指南的

7、诊断标准,经病史、心电图、心肌酶谱、肌钙蛋白和冠脉造影确诊为冠心病的患者共50例,其中男性26例,女性24例,平均年龄(60.12±8.36)岁;选择经询问病史,体检、实验室检查(血、尿、便常规、血脂、血糖、肝肾功能)、心电图、超声心动图、X线胸片及冠脉造影等检查排除冠心病的正常对照组12例。其中男6例,女6例,年龄59.83±7.20岁。各组性别、年龄无显著性差异(P0.05)。研究对象知情同意,试验方案通过伦理委员会鉴定。2、方法2.1所有入选病例均行冠状动脉造影检查,根据冠状动脉造影检查结果并结合临床症状、心电图及心肌酶谱的变化随机分为6组:(1)、正常对照组12例;

8、(2)、无干预冠心病组10例;(3)、40mg/L ox-LDL冠心病组10例;(4)、120mg/Lox-LDL冠心病组10例。(5)、40mg/L ox-HDL冠心病组10例;(6)、120mg/L ox-HDL冠心病组10例。严格登记入选病例一般资料:年龄、性别、血脂指标等。2.2 LDL、ox-LDL、HDL和ox-HDL的制备和鉴定:首先采用密度梯度超速离心法分离LDL和HDL。然后在含10mol/L CuSO_4的PBS溶液中37氧化至颜色由橙黄色转为乳白色(6小时),然后PBS溶液中透析纯化,过滤除菌,BCA试剂蛋白定量,调蛋白浓度至1g/L。聚丙烯酰胺凝胶电泳法鉴定ox-LDL

9、和ox-HDL。2.3单核细胞的分离、培养及鉴定:在行冠状动脉造影前,无菌操作下,从桡动脉或股动脉抽取动脉血20ml,采用Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMC)。在37,5%CO_2培养箱孵育培养4小时后的单个核细胞,此时单核细胞贴壁,轻轻倒去上层未贴壁的淋巴细胞。收集部分单核细胞样本进行台盼兰拒染检测细胞活力;通过单核细胞表面特异性标志分子CD14,利用流式细胞术检测单核细胞的纯度。2.4单核源性巨噬细胞的培养和干预:各组培养的单核细胞用含终浓度为50 ng/ml的氟波脂(PMA)刺激48小时,使之大部分转化为巨噬细胞。光学显微镜观察单核-巨噬细胞。按步骤2.1随机分组给

10、予不同浓度ox-LDL及ox-HDL干预,原条件下培养箱中继续孵育培养48小时。2.5孵育培养48小时后,收集巨噬细胞,Trizol法提取总RNA,总RNA提取产物采用紫外分光光度计检测OD260/OD280比值,并用1.82%琼脂糖凝胶电泳分析方法来确定RNA的量和纯度。2.6 SREBP-2和ABCA1基因序列来自PubMed,引物设计采用Primer Premier5.0引物设计件进行设计。荧光相对定量RT-QPCR法检测不同试验组巨噬细胞中SREBP-2和ABCA1的表达变化。对其扩增曲线进行记录分析,采用CT值进行统计学分析,采用2(-(CT)公式计算SREBP-2和ABCA1相对表

11、达水平。3、统计学处理采用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析,实验结果计量资料以均数±标准差(?)±SD)表示。计量资料多组间差异比较经方差齐性检验后采用单因素方差分析(one-way ANOVA);其中,满足方差齐性的数据组间多重比较采用LSD法,不满足方差齐性的多重比较方法采用Dunnett T3检验。P0.05认为有显著性差异。结果1、不同组间年龄、性别、比较差异均无统计学意义。冠心病组总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、LDL-C较正常对照组高,HDL-C较正常对照组低,各组差异有统计学意义,P值均小于0.05。冠心病各组间TC、TG、LDL-C和HDL-C无

12、统计学差异。2、成功分离出LDL和HDL,并成功制备氧化型脂蛋白。3、成功培养外周血单核细胞来源巨噬细胞,细胞活力检测活力大于95%。4、无干预冠心病组和正常对照组比较,巨噬细胞中SREBP-2和ABCA1 mRNA表达方面无显著性差异。5、40mg/L ox-LDL和ox-HDL干预冠心病组中巨噬细胞SREBP-2表达分别较对照组明显增加,具有显著性统计学差异(P0.05)。120mg/L ox-LDL和ox-HDL干预冠心病组中SREBP-2表达分别与对照组相比较,无明显的统计学差异(P=0.96)。40mg/L和120mg/L ox-LDL干预冠心病组,以及40mg/L和120mg/Lo

13、x-HDL干预冠心病组间比较,巨噬细胞中SREBP-2表达量具有统计学差异(P0.05)。6、40mg/L ox-LDL干预冠心病组中巨噬细胞ABCA1表达较正常对照组明显增加,有统计学差异(P0.05)。120mg/L ox-LDL干预冠心病组中巨噬细胞ABCA1表达较对照组则明显降低,有显著性差异(P0.05)。40mg/L和120mg/L ox-LDL干预冠心病组间比较有统计学差异(P0.05)。40mg/L及120mg/L ox-HDL干预冠心病组巨噬细胞ABCA1表达较对照组明显降低,有统计学差异(P0.05)。并且两干预组间ABCA1表达有统计学差异(P0.05)。结论1、脂质代谢

14、紊乱是动脉粥样硬化的重要危险因素。2、SREBP-2和ABCA1可能不是动脉粥样硬化的独立危险基因,动脉粥样硬化的发病是多种危险因素长期综合作用的结果。3、氧化型LDL能影响SREBP-2和ABCA1 mRNA的表达。在低浓度ox-LDL干预下,SREBP-2表达有增加,这说明在动脉粥样硬化早期ox-LDL可通过增加巨噬细胞SREBP-2介导的胆固醇合成代谢聚集大量的脂质,从而导致动脉粥样硬化的形成与发展。高浓度的ox-LDL干预下,反而有降低SREBP-2的趋势,这可能是由于高浓度ox-LDL对巨噬细胞产生严重的细胞毒性以及SREBP-2的负反馈调节有关。在低浓度的ox-LDL可以上调ABC

15、A mRNA的表达,这说明在动脉粥样硬化早期细胞内ABCA1表达代偿性的增加,从而减少异常增多的ox-LDL摄入,促进细胞内异常增多的ox-LDL排出。但是在高浓度的情况下,高浓度的ox-LDL并不能继续上调ABCA1的表达,反而对ABCA1的表达有明显抑制作用,这可能是由于异常过高的脂质毒性使ABCA1介导的胆固醇逆转运作用受损,导致细胞内异常脂蛋白的大量聚集,从而最终形成动脉粥样硬化斑块。4、氧化型HDL同样对SREBP-2和ABCA1 mRNA的表达有影响。低浓度的ox-HDL刺激增加了巨噬细胞中SREBP-2的表达,而抑制了ABCA1的表达;这种改变一方面与动脉粥样硬化早期巨噬细胞对异常增加ox-HDL反应性有关,另一方面与SREBP-2激活后对ABCA1的抑制作用有关,从而促进了动脉硬化斑块中脂质的聚集。但是高