Westernblot实验操作步骤

1、Western blot实验步骤一、制备蛋白样品（单层贴壁细胞总蛋白提取）1. 倒掉细胞培养液 , 加 3ml 预冷的 PBS洗涤细胞，重复两次，弃掉 PBS后将细胞培养瓶置于冰上。2. 裂解液 RIPA(强)1ml +PMSF10ul(100:1), 两者混匀后加入培养瓶中裂解细胞，冰上裂解 30min, 为使细胞充分裂解 , 培养瓶要经常来回摇动。3. 裂解完后，用细胞刮将细胞刮于一侧 （动作要快），转移至 ep 管中 . 4.4 度， 12000rpm,离心 5min. 离心后取上清至新的 ep 管中，用于后续实验（ -80 保存）常用蛋白收样：倒掉细胞培养基后，预冷 PBS洗涤细胞 2

2、 次，弃去，再加入 1ml PBS，用细胞刮轻轻刮取细胞，转移至 1.5ml ep 管中，12000rpm，离心 5min，尽量吸净上清，沉淀于 -80 保存，用于后续实验。 融化蛋白样品，加入 RIPA+PMSF细胞裂解液（ 200ul/ep 管），充分混匀，冰上裂解20min，4 度离心， 5min ，12000rpm，小心吸取上清至新的 ep 管中。二、蛋白浓度测定 (BCA法)BCA(碧云天 ) 蛋白浓度测定试剂盒灵敏度高，检测浓度下限达到25ug/ml ，最小检测蛋白量达到0.5ug ，待测样品体积为 1-20ul 。 在50-2000ug/ml 浓度范围内有较好的线性关系。标准蛋白

3、 BSA浓度：5mg/ml (-20 保存 ) , 完全溶解蛋白标准品， 取10ul稀释至 100ul ，使终浓度为 0.5mg/ml(ug/ul)。蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。但为了简便起见，也可以用0.9%NaCl或PBS稀释标准品。1. 配置 BCA工作液A液 ： B 液= 50 : 1，混匀 A 液+B液=200ul ( 每个样本 )样本数量： 7 个标准品 + N个待测蛋白样本2. 先将每孔加入 200ul BCA 工作液，再加入蛋白样本。 （96 孔板） , 总体积为 10ul. 待测蛋白样本先 10 倍稀释。96 孔编号#1#2#3#4#5#6#7BSA 标准

4、 0ul1ul2ul4ul6ul8ul10ul蛋白ddH2O10ul9ul8ul6ul4ul2ul0ul96 孔待 测待 测待测蛋待 测蛋10ul/蛋 白蛋 白白样本白 样本well样本 1样本 23N3.37 度，温箱中孵育30min。562nm波长，测 OD值。待测蛋白样品浓度在 50-2000ug/ml 浓度范围内有较好的线性关系。4. 根据所测样品的 OD值，绘制标准曲线。根据标准曲线即可计算样本相应的蛋白含量，除以样本稀释液总体积（10ul ）, 再乘以样本稀释倍数，即为样本的实际浓度（ug/ul ）5. 蛋白定量后，以最小蛋白浓度为标准， 将各组蛋白样本调至相同浓度（ ddH2O补

5、齐）绘制标准曲线： X轴为蛋白质量， Y为 OD值插入 XY 散点图 , 选中图上一点，右键，添加趋势线选项（显示公式，显示 R2，R2>0.99 有意义）三、蛋白变性1. 室温融解 SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（溴酚蓝染料） （2x 或 5x ）2. 将适量蛋白样本与 SDS-PAGE上样缓冲液混合，使其终浓度为 1x 3.100 度或沸水煮 3-5min ，充分变性蛋白。冷却至室温后，直接上样到 SDS-PAGE胶加样孔内即可。或冷却后 -80 保存用于后续实验。四、蛋白电泳1配胶：根据配胶试剂盒操作步骤, 按照目的蛋白分子量大小，选择相应浓度的分离胶。 配胶时最后加 10%过硫酸

6、铵和 TEMED每.板分离胶5ml，浓缩胶3ml. 短板在内侧。配好后如暂时不用，可将胶板取下，电泳液中浸泡， 4 度保存。2. 配电泳液 1x 甘氨酸 -Tris 电泳缓冲液 1LTris3.03g甘氨酸 14.4gSDS1g3. 蛋白上样： 样本 10-30ul( 保证蛋白质量最少为 30ug) 20-25ul 蛋白 Marker 5ul选择较好的孔加样，并记录加样位置4. 连接电极，跑电泳：电泳条件 80V,30min( 蓝色条带到达浓缩胶底部)-110V,90min( 参考 Marker 的位置，蓝色条带跑到胶底部即可 )五、转膜1. 配转膜液： 1LTris 3.03g甘氨酸 14.

7、4g, 加水至 800ml，最后加甲醇 200ml，调至总体积为 1L.2. 切胶： 起胶时将胶留在长玻璃板上，将裁减好的膜做好标记后浸泡在转膜液中。确定目的蛋白的位置（根据 Marker 条带），切胶，保留目的蛋白位置，将膜置于胶上，膜数字面在上，背面与胶相贴，数字标记端贴在 Marker 上。3. 准备转膜：按如下顺序阳极（红）滤纸膜胶_滤纸阴极（黑）4. 连接电极，转膜：90V,90min六、封闭1. 配封闭液： 0.5g 脱脂奶粉 + 10ml PBS2. 取下膜，注意蛋白在膜与胶贴合的一面， 取下后将膜有蛋白面朝下，封闭 1小时七、抗体孵育配抗体稀释液： 0.5g 脱脂奶粉， 10ul Tween, 10ml PBS配洗膜液： 100ul Tween + 100ml PBS一抗孵育， 4 度过夜次日，洗膜液洗 4