持久稳定的大鼠→小鼠造血嵌合体模型的建立(1)

1、持久稳定的大鼠小鼠造血嵌合体模型的建立(1)】 目的： 建立持久稳定的造血嵌合体模型. 方法： 将预处理后的SD大鼠经尾静脉注射BALB/c小鼠骨髓细胞，诱导形成特异性耐受的嵌合体SD大鼠. 30 d后，再将此嵌合体大鼠的骨髓反向移植给致死性照射后的BALB/c小鼠，监测小鼠的存活率，移植后30 d做皮片移植和混合淋巴细胞培养，观察小鼠嵌合率的变化. 结果： 嵌合体模型小鼠仅有轻度移植物抗宿主病的表现，生存期明显延长，移植后嵌合率较稳定，移植皮片存活期延长，与对照组相比有显著性差异. 结论： 通过输入嵌合体骨髓的方法可建立稳定持久的大鼠小鼠嵌合体模型.【关键词】 嵌合体模型；全身照射；骨髓移植

2、0引言大鼠小鼠的骨髓移植，通过对受体进行强烈的清髓性预处理或注射大量骨髓以获得可靠植活，但异种移植物抗宿主病（XGVHD）较强，且嵌合状态随时间延长逐渐消失. 为建立稳定的异种造血嵌合体，我们研究了协调性动物（大鼠小鼠）的骨髓移植模型，因为他们之间不存在天然的抗体，对异种移植物不会发生超急排斥(hyperacute rejection, HAR). 先对供者进行预处理，使其产生对小鼠的特异性耐受，再将此嵌合体大鼠的骨髓反向移植给小鼠. 由于此前嵌合体大鼠已对小鼠产生了特异性耐受，故将此耐受的骨髓植入小鼠体内可明显减轻XGVHD，并诱导出持久稳定的嵌合状态.1材料和方法SD大鼠(SPF级)8只，

3、雌性，810周龄. C57BL/6(H2b)小鼠6只，雌性，810周龄. BALB/c(H2 d)小鼠40只（包括在MLR和病理检查中处死的小鼠，不编入各组计数），雌性，810周龄，均购自第一军医大学实验动物中心,并饲养在清洁实验动物中心层流仓. PE标记的抗小鼠H2DdmAb(PharMingen公司)；FITC标记的抗大鼠MHCCLASSmAb(Serotec公司)；3HTdR（中国原子能研究所）；60Co照射源(广东省辐照中心)；流式细胞仪（FACScan; Becton Dickinson）；自动液闪计数器（Beckman, USA）.1.2.1嵌合体模型的建立SD大鼠于术前5 d开始

4、饮含红霉素(250 mg/L)和庆大霉素(320 mg/L)的抗生素溶液. 无菌条件下取BALB/c小鼠骨髓细胞,制成单细胞悬液, SD大鼠接受8Gy（照射率0.5 Gy/min）全身照射(TBI)后4 h内经尾静脉输入BALB/c小鼠骨髓细胞2108/只,48 h后腹腔注射环磷酰胺50 mg/kg1. 30 h后检测外周血嵌合率为37.39%47.26%，证实小鼠源性骨髓已在大鼠体内植活. 取上述嵌合体SD大鼠骨髓细胞,制成单细胞悬液,BALB/c小鼠肠道净化后接受9 Gy全身照射，随即经尾静脉输入上述嵌合体骨髓细胞4107/只.1.2.2实验分组以BALB/c小鼠为受鼠的A, B, C,

5、D, E组，均接受9 Gy的TBI预处理： A组（8只）输注正常SD大鼠的骨髓细胞; B组（8只）输注嵌合体SD大鼠的骨髓细胞;C组（6只）为自体移植组，D组（6只）为预处理组，不输注骨髓. 以无关第3者B6小鼠为受鼠的E组（6只）输注嵌合体SD大鼠的骨髓细胞.1.2.3组织病理检查出现移植物抗宿主病表现的小鼠,濒死前活杀,B组存活者于移植后第60日处死，取其肝、小肠和皮肤标本,以100 mL/L甲醛溶液固定,常规石蜡包埋、切片,HE染色,光镜下观察. 按Thomas GVHD病理组织学分级标准判定2.1.2.4嵌合率的测定取移植后小鼠外周血,加入FITC标记的 抗大鼠MHCCLASSmAb(

6、每1106细胞中加入1 g),避光,4, 30 min. 红细胞裂解液去掉红细胞,PBS洗涤2次,流式细胞仪检测嵌合率. 1.2.5皮肤移植及存活情况的观察参考文献3的方法,每日观察皮毛,如变硬或脱落视为移植排斥,柔软或鼠毛生长视为移植存活.1.2.6混合淋巴细胞反应（MLR）移植后30 d，分别取A,B组小鼠与正常BALB/c小鼠的脾细胞为反应细胞，以正常SD大鼠与Whistar大鼠脾细胞为刺激细胞，做混合淋巴细胞反应（MLR），丝裂霉素灭活刺激细胞，于96孔培养板每孔加反应细胞4105个和刺激细胞2105个，设自体反应孔，每组3复孔，培养96 h，终止培养前18 h，每孔加入3.7104

7、Bq（中国原子能研究所），液闪计数器测定，结果用Bq值xs表示.统计学处理： 实验所得数据以xs表示, 采用SPSS12.0软件进行数据分析. 用KaplanMeier估计与绘制生存曲线,用方差分析比较各组脾细胞增殖程度的差异，组间多重比较用LSD法，用秩和检验分析各组移植皮片的存活期，用t检验分析外周血白细胞计数和嵌合率.2结果2.1嵌合体模型的生存期A组在BMT后1 wk内出现体质量下降弓背体位、活动度差、毛脏乱等典型GVHD表现，第5日开始死亡并持续下去，仅25%存活超过60 d. B组出现轻微的GVHD, 62.5%存活，与A组比较有显著性差异（Log Rank法比较，P0.05）.

8、C组均存活，D组均在BMT后10 d内死亡. 用KaplanMeier评估生存曲线 (Fig 1)显示嵌合体骨髓细胞的输入可显著延长存活期，GVHD发生率及严重度降低. E组也出现严重GVHD 表现，60 d时存活率仅16.67%.作者：武小娟，李春富，唐湘凤，石磊【关键词】骨髓移植Establishment of stable ratmouse hematopoietic chimer 本篇论文是由3COME文档频道的网友为您在网络上收集整理饼投稿至本站的，论文版权属原作者，请不用于商业用途或者抄袭，仅供参考学习之用，否者后果自负，如果此文侵犯您的合法权益，请联系我们。2.2移植皮肤存活情况

9、BALB/c小鼠对特异供体SD及无关第三者Wistar皮肤的存活情况. 经秩和检验KruskalWallis H法分析，P=0.01，经多重比较，B组BALB/c小鼠对SD大鼠皮肤移植物的存活时间比A组明显延长（Tab 1, P0.05).表1BALB/c小鼠异种皮肤移植物的存活情况（略）2.3混合淋巴细胞反应移植第30日A组与B组小鼠脾细胞对供体SD大鼠脾细胞的单向混合淋巴细胞反应明显降低，经方差分析和LSD法的多重比较检验，与正常BALB/c小鼠相比P0.001， B组脾细胞增殖的抑制程度与A组有显著差别（P0.05）. 移植后60 d的混合淋巴细胞培养结果与30 d时一致.2.4嵌合率测

10、定第30日时测定嵌合体模型的外周血嵌合率（Tab 2），经t检验B组外周血嵌和率与A组比较无显著性差异. 但随着时间推移，嵌合率逐渐下降， A组下降幅度较大，90 d时A组仅 为(12.400.32)% ，B组嵌合率仍有(23.774.50)% (P rat) bone marrow chimeras J. Ann Thorac Surg, 2001;72(3):740-745; discussion 745-746.8 Drevillon C, Elian N, Zinzindohoue F, et al. Prolonged improvement of total pancreatic

11、allograft function by previous intrathymic bone marrow cell injection in rats J. Eur Surg Res, 2003;35(1):1-5.9 van Pel M, Hilbrands L, Smits D, et al. Permanent acceptance of both cardiac and skin allografts using a mild conditioning regimen for the induction of stable mixed chimerism in mice J. Tr

12、anspl Immunol, 2003；11(1):57-63.10 Foster RD, Pham S, Li S, et al. Longterm acceptance of composite tissue allografts through mixed chimerism and CD28 blockade J. Transplantation, 2003;76(6):988-994.作者：武小娟，李春富，唐湘凤，石磊【关键词】骨髓移植Establishment of stable ratmouse hematopoietic chimer 本篇论文是由3COME文档频道的网友为您在网络上收集整理饼投稿至本站的，论文版权属原作者，请不用于商业用途或者抄袭，仅供参考学习之用，否者后果自负，如果此文侵犯您的合法权益，请联系我们。11 Waer M. Mixed bone marrow chimerism across discordant xenogeneic barriers: The solution for inducing xenotransplant tolerance J. Transplantation, 2000；69 (12