实验2 生物微核对环境污染的指示暨细胞有丝分裂相观察

1、实验2 生物微核对环境污染的指示暨细胞有丝分裂相观察2.1 相关基础知识环境的三致性，即指环境中物理或者化学污染物对生物的致畸、致癌、致突变性，是目前环境污染中最主要的问题。三致的根本在于致突变，致畸、致癌常常是致突变的结果。微核是无着丝点的染色体断片，在有丝分裂后期由于不能向两极移动而游离于细胞质中，在间期细胞核形成时，即可在它附近看到若干个很小的圆形结构，直径大约是细胞直径的1/201/5，这就是微核(micronucleus)。微核是常用的遗传毒理学指标之一，指示染色体或纺锤体的损伤。由于这种损伤会因细胞受到的外界诱变因子的作用而加剧，而微核产生的概率又可与诱变因子的剂量呈正比，因此可以

2、用微核出现的频率来评价环境诱变因子对生物遗传物质的损伤程度。各种类型的骨髓细胞中均能见到微核，但某些只有少量胞浆的有核细胞，其核是分叶而有突起的，这类分叶及突起常常被误认为是微核，容易造成计算误差。哺乳动物的红细胞，在成熟过程中将细胞核排出，成为无核细胞，而微核却留在细胞质中不被排出。这样，只要红细胞生成过程中出现过染色体断片，就能在成熟的红细胞内看到微核，一目了然，即使没有多少遗传学知识的人，稍加训练也能从事这方面的计数工作。染色体断裂实际上就是染色体的缺失。如果进行染色体畸变分析，首先要做染色核型分析（包括正常和异常的）。染色体数目多，形状小，则适于做核型分析的中间分裂相不易得到，而且核型

3、分析时需要较好的遗传学知识，还需要较丰富的经验。与之比较，微核试验法是一种不需特殊试剂及设备，且快速而简便的检测方法。蚕豆（vicia faba）根尖微核试验在1986年已被中国环保局列为一种环境生物测试的规范方法，它作为一种环境变异的检测手段，在我国不少地区的环保部门和医疗卫生系统中都有广泛的应用。蚕豆根尖微核实验与染色体畸变试验同样具有准确、快速、操作简便、有明显剂量效应关系、适合大批量样品检测等特点。美国国家环保局也肯定了蚕豆根尖微核试验在环境突变性检测中的作用，对许多环境致癌物都作了标准化的试验，建立了庞大的数据库，并建议在全世界范围内推广。(1) 了解各种环境污染对生物遗传物质的改变

4、，增强环境保护意识(2) 掌握微核试验技术2.3 实验材料和仪器2.3.1实验材料：蚕豆种子2.3.2 实验器材(1) Motic光学显微镜(2) 试管(10ml)×2(3) 蚕豆发芽盒(4) 其它：镊子、手术刀、载玻片、盖玻片、滤纸等。2.3.3 试剂（1） 环磷酰胺（2） 卡诺氏固定液：将乙醇和冰醋酸以3：1(V/V)混和配制；（3） 水解分离液：盐酸与95%酒精1：1混合；（4） 改良苯酚品红染液母液：将3.0g碱性品红溶解在100ml 70%乙醇中，以1:9的比例将其与5%苯酚溶液混和，即得到改良苯酚品红染液母液。（5） 苯酚品红染液：将45ml母液，6ml冰醋酸，6ml 3

5、7%甲醛混合均匀。（6） 改良苯酚品红染液：20ml苯酚品红染液加入180ml 45%乙酸和3.6g山梨醇，静置两周后使用。2.4 实验方法与步骤2.4.1 种子处理将蚕豆种子洗涤干净，室温下用蒸馏水浸泡发芽24小时，然后移入铺有干净纱布的托盘内培养。当初生根长到2cm时，选取发育良好的，大小与根长近似的幼根。将选好的蚕豆芽放入发芽盒中，使根尖完全浸入处理水样中，室温下培养48小时后，用蒸馏水洗涤根尖2次，再用蒸馏水恢复24小时，设蒸馏水处理为空白对照。2.4.2 固定借助于物理方法或化学药剂的作用，迅速透入组织和细胞将之杀死，并且使其结构和内含物如蛋白质，脂肪，糖类以及核物质与细胞器等，在形

6、态结构上尽可能保持生活时的完整和真实状态，同时更易于染色，可以更清楚的显现细胞在生活时不易看清的结构。吸取约5ml卡诺氏固定液于10ml试管中，用刀片或小剪刀切取经过处理的长约0.5-1.0cm的根尖10-20条，放入试管内，用试管塞盖紧，室温下固定20-24h，固定液的用量为材料体积的15倍以上。2.4.3 水解分离水解分离的作用是去除细胞内未固定的蛋白质, 同时使胞间层的果胶类物质解体，细胞分散而易于观察。用镊子取固定好的蚕豆根尖，放在试管内，加水解分离液2ml，室温下处理8-20min，倒去水解分离液，再加入固定液2ml，软化5min，软化对细胞壁起腐蚀作用。然后倒去固定液，用蒸馏水反复

7、冲洗使材料呈白色微透明，以镊子柄轻压能压碎为佳。2.4.4 染色和压片切取蚕豆根尖分生组织放在载玻片上纵横切成几段，放在载玻片上，以十字压片法覆以载玻片，用镊子柄或铅笔头轻敲几下，再用拇指用力下压使细胞充分分散，注意不要移动玻片，然后分开两玻片，各滴上1-2滴染液，染色20-30min后加上盖玻片，注意不要产生气泡，最后用吸水纸吸去多余染液。2.4.5 镜检低倍镜（×10）镜检后，选择细胞分散均匀，细胞无损，染色良好的区域（也可在高倍镜下观察），观察100个细胞，并记下微核数。转到高倍镜(×40)，调节显微镜，寻找有丝分裂各个时期的细胞，并以描点法画出有丝分裂相草图。2.5 注意事项2.5.1 经过固定的材料如不及时使用，可以经过90%酒精换到70%酒精中各半小时，换入70%酒精，04保存半年，再观察时换用固定液再处理一次，效果较好。2.5.2 环磷酰胺使用剂量过大，会导致细胞核变形，而非形成微核，故在实验中应多设浓度梯度处理或进行预实验。2.6 问题讨论2.6.1 根据试验结果判断两种水样何为蒸馏水？何为环磷酰胺溶液？2.6.2 微核试验在环境评价中有何意义？2.6.2 有一种粉末状的化学制剂，如何确定它是否有致突变的作用？2.6.3 在一般良好的自然环境中，动物或植物的细胞是否会出现