缺氧诱导因子

1、12 Exercise training stimulates ischemia-induced neovascularization via phosphatidylinositol 3-kinase/Akt-dependent hypoxia-induced factor-1 alpha reactivation in mice of advanced age.在老年小鼠中通过磷脂酰肌醇3激酶/Akt依赖的缺氧因子1活化运动训练刺激缺血诱导的血管新生因子18、Transcriptional regulation of BNIP3 by Sp3 in prostate cancer.BNIP

2、3通过SP3在前列腺癌中的转录调控。Keywords:· prostate cancer;Sp3;BNIP3;transcriptional regulation;proliferationBACKGROUNDThe transcription factors Sp3/Sp1 are expressed in a various types of cancers and BNIP3 is overexpressed in prostate cancer. Although it has been demonstrated that BNIP3 is transcriptionally

3、 regulated by HIF-1 and is post-transcriptionally regulated by miR145, our previous data indicated that there might be some other transcription factors regulating BNIP3 in prostate cancer.This study is conducted to investigate whether BNIP3 expression is directly regulated by Sp3/Sp1 or not.转录因子SP1

4、SP3 /在各种类型的癌症和BNIP3的表达在前列腺癌中高表达。虽然它已被证明是BNIP3 HIF-1的转录调节，后由miR145转录调控，我们以前的数据表明，可能有一些其他的转录调节因子在前列腺癌中的表达。本研究旨在探讨BNIP3的表达是由sp3 / SP1或不能直接调节MATERIALS AND METHODSBioinformatics analysis shows that BNIP3 promoter contains several potential Sp3/Sp1 binding sites. And then it is demonstrated that SP3 could

5、 regulate the BNIP3 transcriptionally by binding to the predicted sites by dual reporter gene assays, ChIP, and EMSA. The biological effects of SP3 regulating BNIP3 on prostate cancer cells proliferation are measured by MTT, TUNEL, and flow cytometry.生物信息学分析表明，BNIP3启动子包含了几个潜在的sp3 / Sp1结合位点。然后，它表明SP3

6、可以调节转录结合BNIP3的预测双报告基因检测，芯片网站，EMSA。SP3调控BNIP3对前列腺癌细胞增殖的生物学效应是通过MTT法、TUNEL法和流式细胞仪检测。RESULTSOur data show that Sp3 but not Sp1, is positively related to BNIP3 overexpression in prostate cancer.Sp3 can directly regulate BNIP3 transcription by mainly binding to the Sp3 binding sites (624615 and 350343) o

7、f BNIP3 promoter. Knockdown of Sp3 by RNA interference could reduce cells growth and lead to cells apoptosis in PC-3 and DU145. Sp3-dependent BNIP3 overexpression might be an important mechanism to promote prostate cancer cells proliferation.CONCLUSIONThis is the first study to provide direct eviden

8、ce of Sp3-dependent BNIP3 expression. Sp3 might be the major transcriptional regulator of BNIP3 in prostate cancer and it is worthy to further study. The regulation of BNIP3 by Sp3 may be a new cancer-specific therapeutic target in prostate cancer. Prostate 75:15561567, 2015. © 2015 Wiley

9、Periodicals, Inc.NEP表达在常氧和低氧条件下培养的前列腺癌细胞株相比。NEP活性，蛋白水平和mRNA水平均采用酶法测定，Western印迹法和荧光定量PCR分析，分别。电泳迁移率变动分析和染色质免疫沉淀技术（芯片）是用来确认NEP的负调控在转录水平的缺氧反应元件（重点）。进行测试和HIF-1的相互作用细胞共定位和免疫共沉淀。PC3细胞稳定细胞基因稳定表达的细胞PC3细胞，随着他们的控制，利用慢病毒表达系统的建立。进行测试的细胞HIF-1蛋白及其下游基因转录的影响进行Western blot及实时定量PCR。研究缺氧对细胞的潜在作用，细胞生长和克隆形成试验进行稳定表达株PC3细

10、胞进行19、Expression of BNIP3 correlates with hypoxia-inducible factor (HIF)-1alpha, HIF-2alpha and the androgen receptor in prostate cancer and is regulated directly by hypoxia but not androgens in cell lines.BNIP3表达与缺氧诱导因子（HIF）-1的相关性，会和雄激素受体在前列腺癌中，受缺氧直接但没有雄激素的细胞系。Shaida N1,Launchbury R1,Boddy JL1,Jone

11、s C1,Campo L1,Turley H1,Kanga S1,Banham AH1,Malone PR1,Harris AL1,Fox SB1更多相关基因：   BNIP3; HIF1APMID: 18163427影响因子 3.565BACKGROUND:BNIP3 is a hypoxia-induced protein involved in cell death and survival but its role in human tumors is unclear. This study investigated the

12、role of BNIP3 in prostate cancer.METHODS:The expression of BNIP3, the androgen receptor (AR), hypoxia inducible factor (HIF)-1alpha, HIF-2alpha and the hypoxia regulated gene GLUT1 were assessed in tissue microarrays constructed from 149 radical prostatectomy specimens. Statistics com

13、pared expression of these factors between each other, conventional clinicopathological parameters and PSA recurrence. Since an association between BNIP3 and AR and the HIFs was observed, the influence of hypoxia, dihydrotestosterone and the AR blocker, Casodex, was also

14、 investigated in prostate cell lines.RESULTS:BNIP3 was expressed in the nucleus and cytoplasm. Eight of 149 (5.5%) tumors showed no expression, 44/149 (29.5%) cases showed exclusively cytoplasmic expression, 17/149 (11.5%) cases showed exclusively nuclear expression and 80/149 (53.5%) cases sho

15、wed both cytoplasmic and nuclear expression. There was a significant correlation between cytoplasmic BNIP3 expression and Gleason score (P=0.005), age (P=0.02), AR (P=0.001), and GLUT1 (P=0.006). There was a significant correlation between nuclear BNIP3expression and HIF-1al

16、pha expression (P=0.006) and HIF-2alpha expression (P=0.013) but no correlation between BNIP3 and pre-operative PSA, tumor volume, margin positivity or capsular invasion (all P>0.05). There was an increase in BNIP3 expression under conditions of hypoxia (0.1% 0(2) but not with

17、 dihydrotestosterone stimulation or with Casodex treatment.CONCLUSIONS:These findings suggest that BNIP3 is directly regulated by hypoxia but that there may be a hormonal independent mechanism coordinating the expression of BNIP3 in prostate tumors.背景：缺氧诱导BNIP3蛋白参与细胞死亡和生存，但其在人类肿瘤

18、中的作用尚不清楚。这项研究调查了前列腺癌中BNIP3的作用。方法：BNIP3的表达，雄激素受体（AR）、缺氧诱导因子（HIF）-1，HIF-2的调节在149的前列腺癌根治术标本构建组织芯片进行基因GLUT1的缺氧。统计分析比较了这些因子在各因子之间、常规临床病理参数和抗原特异性复发率之间的比较。自从BNIP3和AR和HIF观察之间的关联，缺氧的影响，睾酮和AR拮抗剂，其中，也在前列腺癌细胞株的研究结果：BNIP3在细胞核和细胞质中表达。149，八（5.5%）肿瘤无表达，44 / 149（29.5%）的情况下，表现出专门的细胞质表达，17 / 149（11.5%）的情况下，完全核表达和80 /

19、149（53.5%）的情况下，表现出细胞质和核表达。有一个显着的相关性质BNIP3的表达与格里森评分（P = 0.005），年龄（P = 0.02），AR（P = 0.001），和GLUT1（P = 0.006）。有一个显着的相关性核BNIP3的表达和HIF-1的表达（P = 0.006）和HIF-2的表达（P = 0.013）无相关性，术前PSA BNIP3，与肿瘤体积、边缘阳性或包膜浸润（P > 0.05）。有一个增加BNIP3的表达在缺氧的条件下（0.1%，0（2）但不与双氢睾酮刺激或比卡鲁胺治疗结论：这些结果表明，BNIP3的缺氧还可能是一种激素自主协调机制在前列腺肿瘤的直接调控

20、BNIP3的表达。22、论文题目：HIF-1BNIP3信号通路调节的低氧诱导自噬在唾液腺腺样囊性癌中的作用陈占伟博士学位论文 (专业学位)第一部分低氧诱导唾液腺腺样囊性癌ACCM细胞自噬的实验研究第二部分低氧条件下抑制自噬过程观察腺样囊性癌ACCM细胞侵袭的实验研究大量研究表明低氧状态与肿瘤的侵袭性、血管再生、提高复发率及放化疗耐受性之间存在复杂的联系。作为氧平衡的重要调节因子，HIF-1是在低氧条件下重要的转录因子。HIFl是由HIFl和HIFl B两种亚基组成的异源二聚体，HIF一1是HIF一1的结构性亚基，在细胞内的表达相对稳定：HIF-1是HIF一1的功能亚基，常氧条件下不断合成，同时

21、不断经泛素一蛋白酶小体途径水解。低氧条件下，HIF一1降解受阻，在细胞浆内积聚增多，向细胞核内转移，与HIF-l 结合调节靶基因的转录。HIFl 已经在大多数常见的人类癌症中观察到，如头颈部的恶性肿瘤、卵巢癌和食道癌中，并与不良预后及治疗抵抗相关。 HIF-l作为一种转录因子，其靶基因产物涉及无氧糖代谢、氧输送、新生血管生成和血管扩张等，使肿瘤细胞耐受缺氧，且增加供氧和供能，从而促进肿瘤生长、浸润和转移。HIFl 调节转录的基因中BNIP3(Bcl-2adenovirus E1B19一kDainteracting protein 3)可以仅通过NTAD(HIF-1 Q的一种反式激活域)激活，H

22、IF-l 作用于BNIP3启动子区域的缺氧反应元件(HRE)其核心序列是5一CGTG一3，它是诱导BNIP3表达的最强刺激因子5。BNIP3是包含单BH3区的促凋亡成员，属于Bcl-2蛋白超家族。BNIP3，即Bcl2腺病毒E1B 19 kDa相关蛋白3(BCL2adenovirus E1B19kDainteracting protein 3)，属于促凋亡蛋白，其表达受HIF-1依赖的缺氧的调节及其他很多因素的影响。BNIP3蛋白主要定位于线粒体外膜，当其被激活后，完全整合入线粒体外膜，通过开放线粒体通透性转运孔(mitochondrialpermeability transition por

23、e，MPTP)损伤线粒体功能引起染色质凝聚、DNA分解，最终导致细胞凋亡。近年来，BNIP3的异常表达和很多肿瘤的进展、化疗耐药及自噬密切相关。BNIP3的表达受到转录因子HIF-1a的调控，在低氧诱导细胞自噬凋亡过程中起重要的作用。然而，唾液腺腺样囊性癌中BNIP3的表达、其调节的低氧诱导自噬通路及临床病理学行为国内外尚未有文献报道。自噬指的是从粗面内质网上的无核糖体附着区脱落的双层膜包裹的部分胞质和细胞内需要降解的细胞器和蛋白质等形成自噬体，与溶酶体融合后形成自噬溶酶体，进一步降解所包裹的多余蛋白质和亚细胞成分，来实现细胞本身的代谢需要和细胞器的更新，来维持自身的稳定。其整个过程主要分3个

24、阶段：自噬小体的初步形成；自噬体膜的延伸；自噬体与溶酶体融合并降解。氯喹可以通过升高溶酶体内的PH值，进而阻止自噬体与溶酶体结合而抑制自噬。我们的研究团队在之前调查过79名患有头颈部腺样囊性癌的患者，观察自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链一3(microtubule associated protein 1 light chain 3，LC3)和Beclin1的表达，结果显示二者在腺样囊性癌形成的过程中起重要的作用。近期的研究已经发现低氧状态与诱导自噬之间存在某些联系，然而低氧诱导腺样囊性癌细胞自噬的分子机制尚未完全明确。低氧是实体肿瘤微环境中常见的现象（心衰？）。肿瘤在高速增殖的过程中，血管生成

25、速度显著低于细胞增殖速度，氧供应的速度滞后于细胞对氧的需求；同时，与正常组织相比，肿瘤组织中会产生大量结构和功能异常的血管结构，使得肿瘤中央区域的细胞普遍处于低氧状态。HIFl a调节转录的基因中BNIP3(Bcl-2adenovirus E1B19一kDainteracting protein 3)可以仅通过NTAD(HIF-1 Q的一种反式激活域)激活，HIF-l Q作用于BNIP3启动子区域的缺氧反应元件(HRE)其核心序列是5一CGTG一3，它是诱导BNIP3表达的最强刺激因子5。BNIP3是包含单BH3区的促凋亡成员，属于Bc卜2蛋白超家族。研究表明，低氧可以诱导自噬，并且主要是通过

26、HIF一1 BNIP3通路实现的6，7，8，9。在低氧应激下肿瘤细胞产生大量氧自由基等有害物质损害线粒体并且影响基因的稳定性，此时细胞通过自噬清除受损线粒体，减少受损所致凋亡，保护细胞存活。而这种HIF一1 调节的线粒体自噬可以有效抑制ROS水平的升高和细胞的死亡，从而实现对细胞存活的促进作用6。HIF一1 在低氧条件下水平升高，作为一种转录因子激活BNIP3BNIP3L(Bc卜2adenovirus E1819一kDainteract ing protein 3 like)。通过沉默BNIP3观察低氧诱导的自噬表达也证实BNIP3在HIF一1 调节的自噬中的重要性。在常氧状态下，Beclin

27、 1Bc1-2、Beclin 1Bc1-XL复合物之间低水平的分子亲和力不足以诱导自噬。而低氧诱导的自噬表达证实通过分离Beclin 1Bc1-2、Beclin 1Bc1-XL复合物促进了自噬的表达。此过程中，BNIP3的BH3区发挥了重要作用。仅含BH-3区的BNIP3通过可以轻易的与Beclin-1竞争破坏Beclin 1Bc1-2、Beclin 1Bc1-XL复合物的联系，导致Beclin-l获得释放，从而调节自噬水平的提高10。HIF-1 BNIP3信号通路调节的低氧自噬中，Beclin-1Bc1-2途径主要参与了自噬的调控。Beclin-1基因是At96的哺乳动物同源基因， 是自噬所

28、必需的基因， 在自噬体双层膜形成过程中作用重要11。Beclinl作为肿瘤抑制基因通过调控细胞自噬以维持机体内环境稳定，是III型P13K不可或缺的活化因子。BNIP3就是通过BH一3区的结合释放Beclin一1上调了自噬水平。本课题拟在前期研究证实自噬相关基因的表达与腺样囊性癌的发生发展密切相关的基础上，运用分子生物学观测HIFla、BNIP3、微管相关蛋白轻链3(MicrotubuleassociatedproteirIlightchain 3，MAPLC3)、Beclinl的表达变化，探讨低氧相关基因HIFla、BNIP3以及自噬相关基因MAPLC3、Becl in一1的表达情况，。采用

29、细胞生物学技术，体外培养唾液腺腺样囊性癌细胞系ACCM，应用二氯化钴模拟低氧环境，从而诱导ACCM细胞自噬现象的产生，同时检测HIF-1 aBNIP3信号通路在这个过程中扮演的角色。本课题首次观察低氧诱导的自噬在唾液腺腺样囊性癌中的作用，并进一步探讨HIFlaBNIP3信号通路调节的低氧诱导自噬在唾液腺腺样囊性癌中的重要作用，为今后的预防和治疗提供新的思路和作用新靶点。第一部分讨论在本次试验中，首先我们发现低氧环境下自噬体的生成明显增加、自噬相关基因明显上调；其次，HIF一1与其靶基因BNIP3在低氧诱导腺样囊性癌自噬过程产生中扮演重要的角色。由于不完全的血液供应及对氧气的巨大需求使低氧状态在

30、肿瘤细胞中迅速发展。大量证据表明低氧状态普遍存在于头颈部肿瘤中，并是一种重要的负性因子【18】。为了阐明低氧对腺样囊性癌的影响，我们用二氯化钴来处理Acc-M细胞株来观察肿瘤细胞对低氧状态的反应。二氯化钴已被广泛应用于拟态低氧环境，并可阻碍HIF-1 a的降解从而导致其过表达【19】。此外有的研究倾向于探索二氯化钴是否可以诱导细胞凋亡【20，2l】。本次实验结果显示适当的增加二氯化钴的浓度可以降低细胞的活性。作为转录因子，HIF-1 a转移到细胞核中与HIF-1形成一复合体从而激活几个转录基因，比如BNIP379。BNIP3是BH3omy Bcl2家族成员，被HIF-1调控，是一种很具代表性的

31、低氧反应基因【22。在本次实验中，BNIP3蛋白和mRNA的上调伴随HIF-1 蛋白表达上调。在HIF-1依赖途径中，低氧状态可以很快诱导自噬过程的产生，HIF-1 aBNIP3信号通路在此过程中扮演决定性的角色。在Bcl-xL aIld Beclin 1功能和物理相互作用的研究中证实BH3结构域影响自噬过程【25，26】。因此合乎逻辑的推论是BH3-0nly亚科，例如BNIP3需要进一步的研究。在用二氯化钴处理的ACC-M细胞中我们发现BINP3和Beclin 1的表达均明显上调，同时LC3一II的表达也明显增加。所有的证据均表明二氯化钴模拟的低氧环境能够诱导增加ACCM细胞产生自噬，同时H

32、IF一1BNIP3信号通路在这个过程中起到重要的作用第二部分 低氧条件下抑制自噬过程观察腺样囊性癌侵袭的实验研究自噬是发生在细胞内，吞噬自身细胞质蛋白或细胞器并使其包被进入囊泡，并与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物的过程，是维持细胞的生物合成所必需的3】。越来越多的研究证实自噬过程在肿瘤的发生发展中扮演着一个具有争议的角色：一方面它可以提高肿瘤细胞对不良环境的适应能力，比如低氧状态；另一方面，自噬过程还可以通过降低伤害来保护正常细胞从而限制肿瘤发生【4】23、HIF-1在喹啉酸诱导的PCI2细胞和SH-SY5Y细胞损伤中的作用硕士学位论文 杨开勇方法将体外培养的PCI2和SH-S

33、Y5Y细胞经不同浓度喹啉酸处理不同时间后，分别筛选出喹啉酸诱导细胞损伤的低、中、高剂量及其作用时间，然后将实验分为对照组、喹啉酸低、中、高剂量组及HIF-1抑制剂(2ME2)预处理损伤模型组，分别作用细胞24 h后，采用噻唑蓝还原法和乳酸脱氢酶漏出率检测法测定细胞损伤程度，采用丙二醛和超氧化物歧化酶试剂盒检测细胞内氧自由基水平，倒置相差显微镜观察细胞形态学变化，Hoechst 33342单荧光染色法观察细胞凋亡，免疫荧光染色法检测HIF1在细胞内的表达，免疫印迹法检测细胞HIFls、3-链蛋白(p-Catenin)、糖原合成激酶一313(Glycogen synthasekinase3p，GS

34、K一3)、蛋白激酶B(Akt)、磷酸化Akt(phosphorylatedAkt，p-Akt)、淋巴瘤白血病-2(B cell lymphomalewkmia-2，Bcl-2)和Bcl-2相关x蛋白(Bcl-2Associated XProtein，Bax)的表达。11神经系统疾病与兴奋性氨基酸112神经发育过程中的经典WntCatenin信号通路2121 WntCatenin信号通路的主要组成2122 GSK-3和-Catenin的主要功能313低氧诱导因子-1仅及其抑制剂4131 低氧诱导因子-1的结构和功能4132 HIF-1的抑制剂2-甲氧基雌二醇614科学问题与假设一6141科学问题

35、6142提出假设715研究目的与意义一7151研究目的7152研究意义716研究思路与技术路线7161研究思路7162实验技术路线HIF-1广泛存在于哺乳动物细胞内，是目前发现的一种具有高度特异性能感受细胞氧分压的调控蛋白。HIF-1由氧敏感的HIF-1a和组成性表达的HIF-1两个亚基组成，其中HIF-1是主要的活性亚基22,23。HIF-1 【蛋白由四个功能结构域组成：碱性的螺旋环螺旋(basichelix-loop-helix，bHLH)结构域、参与二聚体形成及与DNA结合(Per-arylhydrocarbon receptornuclear translocator-sim，PER-

36、川矾T-SIM，PAS)结构域，氧依赖降解(oxygen-dependent degradation，ODD)结构域，以及两个转录活化所需的反式激活结构域(transactivation domains，NTAD和CTAD)。HIF113包含bHLH，PAS及转录活化结构域【24】，如图1-4所示。常氧下，HIF-1的半衰期极短，在胞浆中几乎检测不到，一方面，HIF-1a合成后经PHD羟基化，通过希佩尔-林道肿瘤抑制蛋白(pVHL)迅速被泛素化蛋白酶降解；另一方面，FIH(又称HIF-1抑制因子)对于不经蛋白酶体降解途径的HIF-1起二级负向调控作用。在低氧条件下，ODD结构域脯氨酸的羟基化被

37、抑制，阻止HIFl的泛素化降解，HIF-1在胞浆内积聚【25，26，此外，FIH的活性受到抑制，HIFl的转录活性增加【27，28】，继而通过其核定位信号转移至细胞核，与HIF113结合形成异二聚体HIF-1，如图15所示。HIF-1通过作用于靶基因上的低氧反应元件调控基因的表达，参与血管形成、糖代谢、细胞存活和增殖等过程22，2·】。在缺血性或出血性脑损伤后，大鼠脑组织HIF-1表达明显提高【z9，30】；而离体培养的细胞经缺氧缺糖处理后，HIF-1表达也明显提高，且出现细胞核内聚集【31】，表明HIF-1调节了神经细胞的损伤过程。但HIF-1是否调节神经细胞兴奋性损伤，其作用的分

38、子机制目前仍不明确。另有研究表明，磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3kinase，P13K)丝氨酸苏氨酸蛋白激酶(protein serine threonine kinase，Akt)信号通路参与了HIF-1的表达32，33,341。但在神经细胞兴奋性损伤中，是否有HIF-1的参与，若有，HIF-1是促进损伤还是参与保护，以及是否接受P13KAkt信号通路的调节，目前也均不明确。14科学问题与假设141科学问题在神经系统兴奋性毒性损伤过程中，其损伤的分子机制是否与HIF-la有关?若有，HIF1a是参与调节损伤还是损伤预适应?此外，HIF-la的激活是否参与Akt

39、GSK-3-Catenin信号通路的调控?目前均不明确。142提出假设HIF1et参与了喹啉酸导致的PCI2和SHSY5Y细胞损伤。HIF10t的抑制剂2ME2可减轻喹啉酸诱导的PCI2和SHSY5Y细胞损伤。HIF1ct的激活参与AktGSK-3-Catenin信号通路的调控。15研究目的与意义151研究目的探讨HIF-1在PCI2和SHSY5Y细胞兴奋性毒性损伤中的作用及其与AktGSK-3-Catenin信号通路的关系，为证实HIF-l及其信号通路参与神经元兴奋性损伤提供依据。152研究意义明确HIF-1参与了喹啉酸诱导神经细胞损伤及HIF-1仪的抑制剂(2M巳2)对喹啉酸诱导神经细胞损

40、伤具有保护作用。从而对谷氨酸所致的神经系统疾病的预防及治疗提供新的思路。1。6研究思路与技术路线161研究思路人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y细胞和大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤PCI2细胞是较好的神经元模型，被广泛应用于神经毒理学和神经药理学等研究。因此，本课题以PCI2及SH-SY5Y细胞作为实验对象，以喹啉酸损伤作为手段，观察并分析HIF-let抑$1J齐U(2ME2)对QA所致细胞存活率、形态学变化及各种相关蛋(aO-IF-lot、-Catenin、GSK-3D、p-Akt、Akt、Bcl-2、Bax)表达的影响，明确QA所致PCI2和SH-SY5Y细胞的损伤与HIF-1及AkffGSK-3-C

41、atenin信号通路的关系，如图1-6所示。讨论在神经细胞损伤过程中，HIF-1a及其信号通路发挥了重要作用。离体培养的大鼠神经元经缺血样损伤后，HIF-1a表达显著增加并集中于核内，过表达HIF-1a可导致细胞死亡。动物经受各种脑损伤如缺血性损伤、撞击性脑外伤后，脑组织HIF-1a表达上调，HIF-1a抑制剂如2甲氧雌甾二醇则具有明显的保护作用【48，·9】，表明HIF-1a可能参与了神经损伤。但另一些证据却表明HIF-1a可参与了神经细胞对损伤的适应过程：与野生型小鼠相比，神经元特异性HIF-1a基因敲除小鼠对缺氧更加敏感，神经细胞损伤更为严重【50】；HIF-1a抑制剂可减弱低

42、氧预处理引起的星形胶质细胞对氧化损伤的适应作用51】。这些不一致的实验结果提示在神经细胞损伤过程中，HIF-1a可能具有双向适应性调节作用：HIF-1a轻度或中度诱导表达可促进细胞适应损伤，而过量表达则导致细胞死亡【5253】。本实验结果表明，510 mmolL QA作用24 h可显著诱导PCI2细胞HIF-1a表达，且呈现剂量依赖性，表明HIF-1a信号通路可能参与了PCI2细胞损伤过程。同时，HIF-1a的活化受到多种分子的调控，如活性氧可通过激活一些细胞内信号，继而磷酸化HIF-1a的641和643位的丝氨酸位点，使其稳定停留于细胞核内发挥其促基因转录的作用54，55】；Akt也可通过调

43、节其下游分子如叉头样转录因子04(forkhead transcriptionfactor 04，FOX04)、糖原合成酶313(the glycogen synthase kinase-3D，GSK-3p)等导致HIF-la的稳定56,57。本实验结果表明，QA可引起PCI2细胞内活性氧水平升高和Akt的活化，进而导致HIF-1a表达上调，提示ROSAktHIF-1a可能参与了细胞的损伤过程。322QA中剂量组作用不同时间PCI2细胞HIFlot蛋白检测采用免疫蛋白印迹法检测检N5 mmolL QA作用不同时间PCI2细胞内HIF1a蛋白的表达，按照2284的步骤进行。326细胞内HIF-1

44、的表达定位检测328细胞HIF1a、-Catenin、csK-3、Akt、p-Akt、Bax、Bcl-2蛋白的表达检测细胞按照321中的分组经处理24 h后，收集细胞，提取总蛋白并测定蛋白浓度。将30ug蛋白进行SDS-PAGE电泳、转膜并封闭后，加入抗HIF-1(1：1000)、pCatenin(1：looo)、GSK一3 (1：looo)、Akt0：1000)、p-Akt(1：looo)、Bax(1：1000)、Bcl-2(1：lOOO)和GAPDH(1：7 000)抗体于4反应过夜。洗涤后，将膜和相应二抗fl：5 ooo)在室温下反应1 h，以底物化学发光试剂显色后并以凝胶成像系统(Ch

45、ampGel 5000，北京赛智创业科技有限公司)进行扫描，以ImageJ软件分析各条带灰度值。以GAPDH条带灰度值作参照，进行半定量分析。335 2ME2对QA诱导PCI2细胞内HIF1a核转位的影响在细胞处于不同状态下，HIF-1a的表达位置和表达量也出现变化，进而导致其功能的变化。本实验采用荧光免疫组化实验检测HIF-1a在细胞内的表达定位。如所示，在对照组细胞中，HIF-1a几乎不表达；25 mmolL QA处理24 h后，PCI2细胞HIF-1a出现低表达；5 mmolL QA可明显诱导细胞核内HIF-1a高表达；10 mmolL QA处理使细胞核内HIF-1a表达明显提高；10m

46、molL2ME2+5 mmolL QA处理明显抑制细胞内HIF-1a发生核转位(图35)。4讨论第二章的实验结果显示，QA可剂量性导致PCI2细胞出现凋亡，同时诱导HIF-1 高表达，Akt磷酸化，表明AkV/HIF-1 信号通路可能参与了该损伤过程。该结果提示，HIF-1 参与了神经兴奋毒性，抑制HIF-1 及其下游信号通路可能具有抑制兴奋性神经细胞损伤的作用。因此，本章给予HIF-1 的抑制剂2ME2加以验证。如本章图3-1的Western Blot结果显示，随着QA作用PCI2细胞时间的增长，HIF-1 的表达水平逐渐升高。与正常对照组相比，QA作用6h后其表达量显著提高，24 h达到高

47、峰。因此，在24 hCk，将HIF-1 抑制剂2ME2作用于QA损伤的PCI2细胞，观察其能否减轻QA所致细胞活性受损，从而判断HIF-1 【在QA诱导PCI2细胞损伤中的作用。结果表明，与损伤对照组相比，2ME2可促进细胞存活，减少细胞损伤，减轻细胞膜的破坏，细胞透光率增强，胞体皱缩明显减少，轴突变长，并使细胞死亡减少，说明抑制HIF-1 的表达对损伤细胞具有保护作用。此外，2ME2可通过抑制HIF-1 的表达从而阻断HIF-1 通路的信号转导。因此，从形态学上观察2ME2预处理后PCI2细胞内HIF-1 核转位的发生和对细胞凋亡的影响。结果显示，给予HIF-1 抑制剂2ME2后，发现抑制H

48、IF-1 的激活和核转移可以部分阻断兴奋性毒性所致的凋亡的发生。因此，我们认为HIF-1 的激活促进了神经元死亡进程的发生。大量研究显示，缺氧以及非缺氧性刺激下，P13KAkt信号通路在HIF-1 表达和活性调控过程中可能起重要作用63】。p-Akt是P13K激活Akt发生磷酸化的活化产物，Akt只有磷酸化后被活化成为p-Akt时才具有生物学功能，直接或间接影响多种转录因子表达和促凋亡蛋白活性，从而实现整个信号通路的生物活性僻】。但Akt和HIF-1 之间是直接相互调控还是通过其它相关蛋白间接调控?目前鲜有报道。在大鼠创伤性脑损伤模型中，皮层损伤处p-Akt、GSK-3、p-Catenin蛋白

49、表达显著增高，表明激活AktGSK-3-Catenin信号通路可能是导致创伤性脑损伤的机制之-65。在急性脑缺血再灌注损伤模型中，导致大鼠海马CAl区细胞凋亡的同时，伴有Wnt信号通路中关键因子p-Catenin、GSK-3p表达的增加和-Catenin、p-GSK3表达无明显变化，说明Wnt信号通路可能参与缺血再灌注脑损伤的发生发展，对脑缺血细胞凋亡具有促进作用断】。在姜黄素防治AD的体外研究中，给予姜黄素后，GSK-3mRNA和蛋白表达水平都显著减弱；而GSK-3的磷酸化形式GSK-3-Ser9蛋白水平却明显增加；-catenin mRNA和蛋白水平也增加，表明GSK3-Catenin信号

50、通路激活可能是AD的发病机制之-67。上述研究表明，P13KAkt信号通路可以直接调控GSK-3，而-Catenin是GSK-3下游一个很重要的转录激活因子，那么HIF-1 是否是通过AktGSK-3-Catenin信号通路激活而发挥调控作用的呢?目前也不清楚。本章研究Western blot结果显示，随着QA损伤PCI2细胞的浓度增加，HIF-1 、GSK-3、p-Akt蛋白表达依次增加，-Catenin蛋白表达依次降低，Akt蛋白表达没明显变化趋势；在给予HIF-1 抑制剂2ME2预处理后，抑制了HIF-1 、GSK-3、P-Akt蛋白表达的增加，-Catenin蛋白表达的降低，表明HIF

51、-1 、GSK-3及p-Akt参与QA诱导PCI2细胞的损伤，-Catenin参与细胞存活。在损伤过程中HIF-1 、GSK-3和p-Akt表达变化呈正相关，-Catenin表达变化呈负相关，给予2ME2后，验证了上述的表达变化，表明QA损伤PCI2细胞的机制可能是HIF-1 通过竞争-Catenin激活GSK-3介导Akt的磷酸化产生的。在细胞损伤中都有凋亡的存在，细胞的凋亡与抗凋亡之间存在一种精细的平衡，当细胞受到外来刺激时，这种平衡被打破，启动细胞的凋亡程序68-691。Bax是一种凋亡前体蛋白，是p53的靶基因，Bax可刺激细胞色素C和其他凋亡诱导因子的外流，诱导细胞凋亡；与此相反，B

52、cl-2抑制细胞色素C的释放和Capase成员的激活，阻止细胞凋亡，而受到外来化学刺激时，BaxBcl-2值是细胞存活的指标【70】。Bcl-2过表达可能削弱NMDA诱导凋亡和细胞毒性，从而延长细胞的生存时间和维持细胞的稳定性。本研究Western blot结果显示，2ME2抑制了QA所导致的BaxBcl-2值依次增加，表明2ME2可减轻细胞凋亡的程度。综上所述，本章实验结果表明，HIF-1 抑制剂2ME2能够减轻喹啉酸致PCI2细胞的损伤程度，减少细胞凋亡；该过程的分子机制可能是通过抑制HIF-1 的激活从而阻断AktGSK-3-Catenin信号通路进而调控凋亡相关蛋白产生的。第四章2甲氧

53、基雌二醇在喹啉酸诱导SH-SY5Y细胞损伤中的作用第三章研究表明，喹啉酸诱导PCI2细胞损伤的机制之一可能是通过HIF-1 激活AktGSK-3-Catenin信号通路进而调控凋亡相关蛋白产生的。PCI2细胞是大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞，因其具有具有神经元特质，常被用于模拟神经细胞进行体外实验，但其属于鼠源细胞株，因此，为了观察和证明不同属源的细胞是否具有特异性差异，本章选用与正常神经细胞生理生化功能相似的人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞进行验证，该细胞株也常被用于体外模拟神经元损伤的研究。41材料和方法41 1细胞株人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y细胞株购自中国科学院上海细胞库。421 细胞培

54、养及实验分组将SH-SY5Y细胞用含10新生牛血清、1×105 UL青霉素、100 mgL链霉素的高糖DMEM培养基培养，置于含5C02和95空气的37培养箱中，每2 d换液1次，4 d传代1次，取对数生长期细胞进行实验。 将SH-SY5Y细胞以5×104mL密度接种于96孔或24孔,板，置于培养箱中培养24 h后，加入不同浓度的QA分别处理不同时间(筛选出QA低、中、高的浓度分别为225，45，9 mmolL；时间为24 h)。故将实验分为对照组、QA低剂量组(225 mmolL)、中剂量组(45 mmolL)、高剂量组(9 mmolL)及HIF-1a抑制剂2ME2(20

55、 gtmolL)+QA高剂量组(9 mmolL)，其中2ME2预处理30 min。对照组细胞中加入相同体积PBS。422 QA高剂量组作用不同时间SH-SY5Y细胞HIF-la蛋白检测采用免疫蛋白印迹法检测检测9 mmolL QA作用不同时间SH-SY5Y细胞内HIF-1a蛋白的表达，按照2284的步骤进行。423 MTT法检测细胞活力以MTT还原法检测细胞存活率。五组药物处理结束后，培养板每孔中加入MTT(终浓度为05 mgmL)，37反应4 h，吸去上清后每孔加入100止二甲基亚砜，振荡5 min，置酶标仪上于490 nlTl处测定各孔吸光度值。具体方法参照222。423 LDH法检测细胞

56、毒性424细胞形态学检测425细胞内HIF-1 的表达定位检测426细胞凋亡检测将SH-SY5Y细胞接种于玻璃片上，按照421中的分组经药物处理24 h后弃去培养液，经PBS洗涤后，用冰甲醇固定细胞10 min。吸去固定液，用PBS洗涤后加入Hoechst 33342染色液(终浓度为1 0 BgmL)-T-室温下反应5 min，在荧光显微镜下观察并拍照。427细胞HIF-1 、pCatenin、GSK一3p、Akt、p-Akt、Bax、Bel-2蛋白的表达检测44讨论本章旨在第二和第三章的实验基础上，观察和证明常被用于体外模拟神经元损伤的不同属源的PCI2细胞和SH-SY5Y细胞是否具有特异性

57、差异。本章实验结果与第三章的结果基本相同，表明PCI2细胞和SH-SY5Y细胞在QA导致的兴奋性毒性损伤中不存在明显差异，但在比较第三章和第四章的结果时发现，PCI2细胞比SH-SY5Y细胞对QA诱导的损伤更为敏感。本章实验结果41显示，QA可呈时间和剂量依赖性的降低细胞存活率，增加细胞损伤：其中，225 mmolL QA对SH-SY5Y细胞损伤不明显，45 mmolL QA才对SHSY5Y细胞造成明显损伤，与文献报道相一致73】，而25 mmolL QA即可导致PCI2细胞出现明显损伤，说明PCI2细胞比SH-SY5Y细胞对QA诱导的损伤更为敏感。此外，因对QA诱导PCI2细胞和SH-SY5Y细胞损伤所筛选的浓度不一致，因此，HIF1a在QA诱导SH-SY5Y细胞损伤中的表达峰值时间也可能不同，故本章实验选用9 m