精品资料（2021-2022年收藏的）生物技术制药试验

1、生物技术制药实验武汉大学药学院 生物技术实验室湖北·武汉目 录实验一 质粒DNA的小量制备2实验二 质粒DNA电泳鉴定4实验三 感受态细胞的制备和转化5实验四 目的基因的表达及表达产物的初步提取8实验五 蛋白质纯化盐析沉淀法10实验六 凝胶过滤层析14实验七 蛋白质免疫印迹实验（Western Blotting）16实验八 HRP结合物的过碘酸钠交联法19 实验一 质粒DNA的小量制备【目的】学会最常用的碱裂解法小量制备质粒DNA的方法。【原理】 根据共价闭合环状质粒DNA与线性DNA在拓扑学上的差异来分离。在pH12.012.5这个狭窄的范围内，线性DNA双螺旋结构解开而被变性。尽

2、管在这样的条件下共价闭合环状质粒DNA也会变性，但两条互补链彼此互相盘绕，仍会紧密结合在一起。当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液使pH恢复中性时，共价闭合环状质粒DNA复性快，而线性的染色体DNA复性缓慢，经过离心与蛋白质和大分子RNA等发生共沉淀下去而被去除。【器材】超净工作台，接种环，酒精灯，台式离心机，旋涡混合器，微量移液器，1.5ml微量离心管，恒温摇床，试管，双面微量离心管架，试管架，标签纸，磁力搅拌机。【试剂】pET-28a质粒载体菌, LB培养基1000ml（含10mg/ml卡那霉素），葡萄糖/Tris/EDTA 溶液（溶液 I），NaOH/SDS溶液 （溶液 II），KAc溶液

3、（pH4.8）（溶液 III），RNase A，95%乙醇，70%乙醇，TE buffer（pH8.0）。【实验准备】 1. 配制卡那霉素储存液（无菌水配制10mg/ml，分装后-20°C保存）。2. 配制LB培养基（胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g加200mL 双蒸水搅拌完全溶解，用约200mL 5N NaOH调pH至7.0，加双蒸水至1L，121°C灭菌20min）。3. 溶液I（50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris HCl pH8.0，10mmol/L EDTA pH8.0）。溶液可成批配制，每瓶约100ml,在高压下蒸气灭菌15分钟，

4、贮存于4。溶液II（0.2mol/L NaOH，1% SDS）；溶液III（60mL 5mol/L Kac，加冰乙酸调pH4.8，补双蒸水至100ml）。4. 70%乙醇（-20°C保存）。5. TE buffer（10mmol/L Tris HCl pH8.0，1mmol/L EDTA ，pH8.0）。6. 试管洗净并塞上棉塞，1.5ml离心管装入灭菌盒，移液器吸头装入相应的吸头盒，高压灭菌（121°C， 30min）。【操作步骤】1. 在超净工作台中取5ml LB（Amp+），加入灭菌的试管中。2. 取出保存的携带pET-28a质粒的菌种, 在超净工作台上用接种环移取少

5、量菌种至5ml无菌的LB培养液（含10ug/ml卡那霉素）中，37°C摇床中振荡培养20h。3. 取1ml的菌液至1.5ml离心管中，12000 rpm离心1min，弃上清液（尽量弃干净），留沉淀备用。4. 在沉淀中加入预冷的100ml 溶液I，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀，室温下静置5min。须确使细菌沉淀在溶液中完全分散。5. 加入200ml 溶液II，盖紧管口，快速颠倒离心管次。应确保离心管的整个内表面均与溶液接触。切勿剧烈振荡。冰浴中放置5min。6. 加入预冷的150ml 溶液III，盖上盖后上下颠倒几次混匀，冰浴放置5min。7. 12000 rpm离心5min，小心吸

6、取400ml 上清液于另一个干净的1.5ml离心管中，（不要将白色沉淀物带入！），加入800ml 95% 乙醇，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀，室温下静置5min。8. 12000 rpm离心10 min，小心弃掉上清液，加入500ml 70% 乙醇，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀。12000 rpm离心10 min，小心弃掉上清液，倒置尽量流尽。9. 再加入500ml 70% 乙醇，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀。12000 rpm离心10 min，小心弃掉上清液，尽量倒置弃干净，可将离心管倒置于一张纸巾上，以使所有液体流出。10. 离心管倒置于37°C温箱中（或室温）空气干燥10

7、分钟。11. 加入10mLTE缓冲液，涡旋混合器上轻微振荡混匀，离心机中瞬时离心将溶液收集于管底。用记号笔标记后放入冰箱中冷藏待电泳确认。12. 在剩余的菌液中倒入少许新洁尔灭，待溶液变清亮后随废液和剩余的冰块一起倒入下水池。清理桌面，清洗仪器。13. 撰写实验报告。【思考】影响本实验结果的主要因素有哪些？实验二 琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒DNA【目的】学会常用的琼脂糖凝胶电泳法分离和鉴定DNA。【原理】DNA双螺旋分子骨架两侧带有含负电荷的磷酸根，在电场中会向正极方向移动。不同长度的DNA由于受到凝胶介质的阻力不同，表现为不同的迁移率而被分开。【器材】电泳仪，水平凝胶电泳槽和梳子及其制胶模块，2

8、50ml三角瓶，微波炉，台式离心机，旋涡混合器，凝胶成像系统，分光光度计，微量移液取样器，1.5ml离心管，双面微量离心管架，试管架等。【试剂】 pET-28a，TAE电泳缓冲液，1000´溴化乙锭储存液，电泳级琼脂糖粉，10´加样缓冲液（或6´加样缓冲液），DNA分子量标准（DNA Ladder:100，200，300，400，500，600，700，800，900，1000，1500 bp）。 【实验准备】 配制TAE电泳缓冲液（50´储存液，pH约8.5：Tris碱 242g，57.1ml冰乙酸，37.2g Na2EDTA.2H2O，dd wate

9、r 定容至1L）；1000´溴化乙锭储存液（0.5mg/ml：50mg溴化乙锭溶于100mL 双蒸水，4°C避光储存）；10´加样缓冲液（20% Ficoll 400，0.1mol/L Na2EDTA pH8.0，1.0% SDS，0.25%溴酚蓝）；6´加样缓冲液；1.5ml离心管装入灭菌盒，移液器吸头装入相应的吸头盒，灭菌。【操作步骤】1. 称取0.5g琼脂糖粉，放入三角瓶，加入50ml TAE电泳缓冲液(1´)，放入微波炉中加热溶解（1min）。注意观察烧瓶中的琼脂糖粉末，待完全熔化后停止微波（切不可让胶溶液溢出到微波炉中！）。2. 戴上

10、线手套，从微波炉中取出三角瓶，置桌面上冷却致50-60°C（手接触瓶壁不感觉烫）。3. 把梳子插到凝胶灌制模具的正确位置后缓缓倒入胶溶液。胶溶液倒至与模具的矮边缘相平即可，不要把胶溶液溢到外面。静置10-20分钟待胶完全凝固。在水平电泳槽中加满1´TAE电泳缓冲液。根据电泳槽的长度把电泳仪的电压调至170V(10V/cm)，注意正负电极的位置连接正确。4. 待胶完全凝固后（15-20分钟），小心拔出梳子。用手指捏住模具两侧的高边缘取出模具和凝胶放入电泳槽中间的平台上，凝胶要没入电泳液中。凝胶上有样品孔的一侧要朝向电泳槽的负极。5. 剪1片光面纸（或封口膜），点6ml蒸馏水、

11、1ml 10´加样缓冲液，再加入3ml质粒DNA溶液制成10ml DNA样品。6. 在凝胶上选择相邻的加样孔。用10ml的吸液头分别将管中的样品加入凝胶的加样孔中（如果需要时，在相邻的加样孔中加入1.5-3ml DNA分子量标准物）。加样时持移液器的手以肘部固定在桌上，用另一只手扶住这只手的手腕，以减少移液器的抖动。看到蓝色的样品吸管尖头伸进加样孔后（不能伸得太深，以免穿破凝胶的底部）缓缓将蓝色的样品压入加样孔中。切不可使蓝色样品流到孔外。7. 打开电源开关，样品将形成一条蓝色的横带向前移动（如果发现蓝色向后移动，立即关闭电源，调换电极）。电泳将进行约30min。8. 当蓝色的溴酚蓝

12、迁移到距凝胶边缘1cm时，关闭电源。取出模具和凝胶。9. 把凝胶小心反扣放入盛有EB的搪瓷盒中。放置约10分钟后，取出用自来冲洗两次。10. 清理垃圾。染有EB的凝胶要放到专用的垃圾袋中作专门处理，以免污染环境。11. 撰写实验报告。【思考】（1） 泳道中的质粒DNA有几条带？为什么？（2） 影响本实验结果的因素有哪些？实验三 感受态细胞的制备和转化【目的】了解和掌握感受态细胞制备与转化的原理和操作步骤，获得转化有质粒pGEX-6p的转化菌株。【原理】转化作用是在一定条件下，一种特定的DNA分子（供体或称转化因子）转入到一定的细菌体内（受体菌），使其发生遗传形状改变的过程。在正常生长条件下，少

13、数细菌可发生转化作用，但大多数细菌并不发生转化，只有在一定条件作用下（如用Ca+处理细菌细胞或电刺激），细菌呈现感受状态后，外源DNA才能转化进入受菌体内。因此，若想将外源DNA分子转化进入一定的受菌体内，通常需将受体菌先制备成易感受状态。感受态通常指的是细菌具备吸收转化因子的一种生理状态。产生感受态细胞的理论机制目前除有一些假说外，并无统一的结论。一般说来，细菌细胞在对数生长的早中期，经处理后，有一定的转化能力，但在它们进入静止生长期以后，就逐渐丧失。因此进行细菌细胞转化时，掌握合适的细菌培养时机是很重要的。本实验所用的供体DNA分子为一个重组质粒，含有编码日本血吸虫谷胱甘肽硫转移酶（GST

14、）的基因。因此可在受体菌体内将表达出GST。实验中所用的受体菌为大肠杆菌BL21（DE3）选择此菌株是因为可用乳糖替代IPTG作为目的基因表达的诱导剂，使实验的进行更为经济。【器材】超净工作台HBY恒温摇床台式高速离心机恒温培养箱721分光光度计高压灭菌锅灭菌Eppendorf管 试管 微量移液枪 培养皿灭菌离心管 移液管 涂布棒【试剂】LB液体培养基： 1000ml含蛋白 10g 酵母提取物 5g NaCl 10g，溶于950ml双蒸水中，用NaOH调pH至7.0，然后定容为1000ml。15磅20分钟高压灭菌。需加抗菌素时，冷却至50以下，加入相应浓度的抗菌素。LB固体培养基：向LB液体培

15、养基中加入2.0%的琼脂粉，15磅20分钟高压灭菌，然后加入适量抗菌素，向每个平板中倒入15-20mlLB固体培养基，凝固后倒置，4保存。转化试剂：CaCl2溶液（lM）：取54g CaCl2·6H2O溶于20ml无菌水中，15磅20分钟灭菌后，分装成小份于4保存。菌株与质粒：大肠杆菌BL21（DE3）hsdSgal（cits857indlsam7ni5lacuv5-T7 genel）。质粒pGEX-6p。【操作步骤和方法】1. 大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞的制备将一BL21（DE3）单菌落种于20mlLB液体培养基中，37振荡培养过夜。取5ml上述菌液转种于50ml培养液中

16、，37 振荡培养约1小时，至0.D600值为0.4-0.5左右，停止培养，菌悬液于冰上冷却10分钟后，转至40ml灭菌离心管中，在4，4000rpm离心10分钟，弃上清，菌体悬于10ml预冷的无菌的0.1M CaCl2溶液中，冰浴15分钟，然后在44000rpm离心10分钟。弃上清，菌体重新悬于2ml预冷的无菌的0.1M CaCl2溶液中，置冰上3-4小时后即制得感受态细胞。2. 重组质粒pGEX-6p DNA的转化取上述感受态细胞200µ1，加重组质粒DNA2µ 1（约10ngDNA），混匀后，冰上作用30分钟，然后转到42水浴 进行热休克90秒，快速转移样品到冰浴，预冷

17、1-2分钟，加0.8mlLB液体培养基，37培养45分钟后取原液各0.2ml涂布Amp平板，同时将0.2ml感受态细胞涂布于Amp平板作为对照。倒置平板，37恒温培养箱中培养12-16小时，观察对照转化的平板，观察转化子出现的数目，计算转化效率。所得的到的单菌落即为菌株BL21（DE3）pGEX-6p。 注：转化效率计算公式如下： 转化子总数 转化频率= DNA加入量 =转化子/µg DNA 转化子总数=转化菌落数*稀释倍数*转化反应液体积【思考】：1. 试总结出实验成功的关键步骤。2. 用乳糖作为BL21（DE3）菌株目的的基因表达的诱导剂的作用机制是什么？3. 在用氨苄青霉素作为

18、抗菌素筛选转化子是，一般37培养时间不超过20小时，为什么？4. 氯化钙转化与电转化相比有哪些优点和缺点。实验四 目的基因的表达及表达产物的初步提取【目的】 掌握目的基因的表达及其产物的提取方式，学会优化外源基因的表达方法。【原理】 要使目的基因的表达量达到一定规模，除了在细菌培养的数量上要扩大之外，还要严格控制最优化表达条件，特别是控制培养温度。因为我们知道，在诱导剂的诱导下，培养物在37情况下培养时，表达的目的蛋白以包涵体的形式存在，大量聚积在宿主细胞的细胞质内，而当培养物在20情况下培养时，目的蛋白则以可溶状态出现。 蛋白质在大肠杆菌中高水平的表达，常常导致产生细胞质颗粒，这些颗粒以包涵

19、体形式存在，能通过相差显微镜观察到，并能通过离心的方法将其从细胞裂解物中分离出来，通过Triton X-100和EDTA或低浓度尿素的作用，即可获得较纯净的包涵体，用8M尿素或6M盐酸胍可以使包涵体溶解。而BL21（DE3）.pGEX-6p细菌在20被乳糖诱导时，产生可溶性的GST。这一可溶状态的融合蛋白在经过细胞裂解，除去细胞碎片，经盐析、脱盐、离子交换柱层析，凝胶柱层析纯化后，即可获得较纯净的融合蛋白。盐析、脱盐、离子交换柱层析，凝胶柱层析纯化目的蛋白将在下面实验中详细介绍，本实验将只进行可溶性目的蛋白的初步提取。【器材】超净工作台高压灭菌锅恒温摇床台式高速离心机721分光光度计超声波破碎

20、器蛋白质SDS-PAGE系统试管 三角瓶 离心管【试剂】溶霉菌 （10mg/ml溶于10mM Tris Cl pH8.0）Triton-1000.5M/L 尿素8M/L 尿素裂解液： 50ml Tris Cl （pH8.0） 1mM EDTA 100mM NaCl含1mM ENTA的PBSPBS： NaCl 8g， KCl0.2g， Na2HPO41.44g， KH2PO4 0.24g加双蒸水800ml，用HCl调pH到7.4，再加水到1000ml，分装后，15磅20分钟灭菌。100mM PMSF 母液：17.4mg/ml溶于异丙醇，-20保存。【操作步骤和方法】 1.诱导表达 将一BL21（

21、DE3）pGEX-6p的单菌落接种于50ml含Amp（100µg/ml）的LB液体培养基中，37，250rmp振荡培养过夜。分别取10ml转种于150ml含Amp（100µg/ml）LB液体培养基中， 37，250rpm继续培养，直至OD600值为1.0，加入10%乳糖至终浓度为1%，从各自加乳糖诱导开始计时，在20，250rpm振荡培养16小时。各取1ml菌液经煮沸理裂解后进行12%SDS-PAGE检测，将剩余的培养物离心收集菌体。 2.可溶性目的蛋白的提纯： 将经20诱导表达的BL21（DE3）pGEX-6p菌液小心转入离心管中，4 ，000rpm离心收集菌体，按3ml

22、/g（湿重）加入含1mM EDTA 的PBS，加入8µl 50mM PMSF悬浮液。加入80µl溶霉菌（10mg/ml）作用30分钟，超声波处理菌悬液，每间隔1分钟超声波处理30秒，反复进行，直至细菌裂解。在4下，13，000rpm离心15分钟，上清即为含有目的蛋白的粗提液。取100µl粗提液进行12%SDS-PAGE凝胶电泳检测。将此粗提液经过盐析、脱盐、离子交换层析，凝胶柱层析纯化，即可获得目的蛋白纯化产品，最后的纯化实验将在以后进行。【思考】 请思考溶菌酶和超声波处理在细菌细胞裂解过程的作用有何不同？实验五 蛋白质纯化盐析沉淀法【目的】采用硫酸铵盐析法将日本

23、血吸虫谷胱甘肽硫转移酶融合蛋白从大肠杆菌BL21（DE3）pGEX-6p细胞裂解液中分离出来，使学生学习掌握制备细胞裂解液的技术和采用盐析法从中分离目的蛋白质的技术。【原理】 用盐析法从成分复杂的蛋白质溶液（如细胞裂解液）中提取目的蛋白质是一种传统的目前仍被广泛使用的蛋白质分离纯化技术。此种技术的工作原理如下：蛋白质在稀盐溶液中，其溶解度会随盐浓度的升高而增加，此种现象被称作盐溶。但是当盐的浓度继续增高时，蛋白质的溶解度又以不同程度地下降并先后从溶液中析出，此种现象被称为盐析。上述现象 是由于蛋白质分子中极性基团之间存在静电力。在低盐浓度下，蛋白质分子中极性基团之间的静电力受盐离子的影响而被消

24、除，蛋白质在水中的极性基团的电荷被中和，水化膜被破坏，于是蛋白质分子之间相互聚集并从溶液中析出。盐析法就是根据不同蛋白质在一定浓度的盐溶液中溶解度降低程度的不同而达到彼此分离的方法。 盐析的一般操作步骤是，选择一定浓度范围的盐溶液（如0-25%饱和度的硫酸铵）使部分杂质呈“盐析”状态从溶液中沉淀出来，经离心法去除。而目的蛋白质呈盐溶状态，存在于上清中。增加盐浓度（如25-60%饱和度的NH4SO4）使目的蛋白质呈盐析状态，而从溶液中分离出来。在盐析时，蛋白质的溶解度与溶液中离子强度的关系，可用下式表示： Slg = -Ks×I S0式中的S为蛋白质在离子强度为I的溶解度，S0蛋白质在

25、纯水（离强度为0）中的溶解度；KS为盐析常数。离子强度I可用下式表示：I=1/2Z2式中，M-溶液中各种离子克分子浓度 Z-各种离子所带的电荷数在温度恒定时，S0对于某一种蛋白质在某一溶液中的溶解度是一个常数，lgS0也为一常数，以代替，故式（1）可以改写为：lgS=-Ks×I （3）值主要与蛋白质的结构，盐离子的平均半径以及盐离子的电荷数有关，也受溶液中的氢离子浓度（PH值）和温度影响。一般来说，蛋白质在某一盐溶液中的盐析系数-KS越大，盐析效果越好。由于蛋白质含有许多亲水基团，需要在较高的I植下才能从溶液中析出。由式（3）可以看出，在一定的温度和PH值下，改变盐的离子强度（I）可

26、以把不同的蛋白质从溶液中沉淀出来。此种方法称为“KS分段盐析法”,常用于蛋白质的初步提纯。在一定的的I值下，改变温度及PH值，使蛋白质从溶液中沉淀出来，称为“分段盐析法”，常用蛋白质纯化过程的后期，特别是某些蛋白质结晶析出时。蛋白质盐析常用硫酸铵等中性盐。硫酸铵因其溶解度大（25时的饱和硫酸铵溶液的摩尔浓度为4.1M，即767克/升，0时为3.9M，676克/升），温度系数小而被广泛使用。硫酸铵价格便宜，不易引起蛋白质变性并具有稳定蛋白质的作用，分段效果比其他盐类好，废液可以作肥料，对环境无污染。其缺点是，其NH+4对用凯氏定氮测定蛋白质含量有干扰，硫酸铵溶液的PH常在4.5-5.5之间,其缓

27、冲能力比较差。有时用硫酸钠.。蛋白质盐析时,盐的浓度一般以饱和度表示，饱和溶液的饱和度定为100%。用硫酸铵盐析时，溶液饱和度调度方法有三种，一是当蛋白质溶液体积不大，需调正的浓度不高时，可以向蛋白质溶液中添加饱和盐溶液。另一种方法是向蛋白质溶液中直接添加磨碎的盐结晶粉末，此种方法用于需要的盐浓度高，而且蛋白质溶液体积不宜过分增加时。第三种方法是将待盐析蛋白质的溶液装于透析装内对饱和硫酸铵进行透析，此法盐浓度变化比较连续平稳，不会出现局部过高现象。但是盐析时需要测定盐的饱和度，过程复杂，较少应用。采用方法一时，所需添加的饱和盐溶液的体积可按下式计算： S2-S1V=V0 1-S2式中，V饱和盐

28、溶液的体积 V0原溶液的体积 S1原溶液的饱和度 S2要达到的饱和度采用第二种方法时，可从附表一中选择要达到某一浓度时所需添加的固体硫酸铵量。影响蛋白质盐析的因素：（1） 蛋白质溶液中盐的浓度。不同蛋白质的盐析要求盐的饱和度不同。从成分复杂的蛋白质溶液中分离蛋白质时，盐的饱和度应由稀到浓渐次增加。每出现一种蛋白质沉淀就应将其分离除去后，再继续增加盐的饱和度，使第二种蛋白质沉淀出来；（2） 蛋白质溶液的PH值。在蛋白质的等电点时，蛋白质的溶解度最小而容易沉淀出来，因此盐析时应将PH值调节在目的蛋白质的等电点附近；（3） 蛋白质浓度。在相同盐析条件下，蛋白质浓度越大越易被盐析沉淀。但是浓度太高时，

29、易使杂蛋白共沉淀；（4） 温度。浓盐溶液对蛋白质有一定的保护作用，因此一般的盐析操作可以在室温下进行。【材料和器材】1. 实验材料（1） 大肠杆菌BL21（DE3）pGEX-6p细胞裂解液，由上一实验提供（2） 分析纯硫酸铵：用干净的磁研钵研成细粉末。30%三氯乙酸,SDS-PAGE所需试剂2. 器材100ml烧杯，50ml离心管，高速冷冻离心机,微量离心管(1.5ml)10支,聚丙烯酰胺凝胶电泳仪一台,1ml,200l,20l移液器各1把,1ml,200l和20l枪各1支,微量离心管支架,磁力搅拌器及搅拌磁棒。【操作步骤和方法】1. 盐析曲线的测定对于一求知盐析特性的蛋白质来说，用盐析作为一

30、纯化步骤时，应首先用实验确定使此种蛋白质盐析沉淀出来的最佳饱和度，其测定方法如下： （1）取7支微量离心管，用记号笔在管帽上标记20%、30%、40%、50%、60%、70%和80%；（2）以上述离心管作容器分别称取磨细的硫酸铵晶体末0.057克、0.088克、0.122克、0.156克、0159克、0.235克和0.281克；（3）分别向上述装有（NH4）2SO4粉末的离心管中添加0.5ml细胞裂解液，充分振荡使（NH4）2SO4溶解后，在室温下静置2小时；（4）将离心管放置于离心机中，以1000转/分转速离心5分钟后，倾去上清，倒立离心管，以便尽可能多地去除上清；（5）添加0.5ml蒸馏水

31、及8l30%三氯乙酸混匀,静置10分钟后,离心,尽量去除上清；(因此步会造成蛋白质不溶影响后续工作，所以省略) （6）将离心管置于快速干燥器中干燥30分钟；（7）向离心管中添加100ISDS-PAGE上样缓冲液悬浮沉淀后，在沸水浴中煮沸3分钟，取出置-20冰箱中备用；（8）制备SDS-聚丙烯酰胺凝胶；按下列上样顺序向加样孔中添加10l 样品：样孔 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10包涵体样20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 包涵体 空白对照电泳分离后，染色、脱色、观察目的蛋白质出现在何种浓度的（NH4）2SO4盐析样孔中，以确定最佳的盐析条件。2. 盐析1. 将50m

32、l细胞裂解液置于100ml烧杯中，加入搅拌磁棒后放置在磁力搅拌器上2. 在搅拌状态下缓缓加入研细的（NH4）2SO4末至最佳饱和度之前的一级饱和度，静置2小时后,离心得上清3. 在搅拌下向上清中添加研细的（NH4）2SO4粉末，使终浓度达最佳饱和度，静置2小时后离心收集目的蛋白沉淀4. 将沉淀的蛋白质溶解于尽量小体积的磷酸盐缓冲的生理盐水中，用Bradford试剂测定蛋白质浓度后，置-20冰箱中保存备用。【思考】 1. 为提高蛋白质盐析分离效率，应采取哪些措施？2.为测定用硫酸铵盐析法分离某种蛋白质的最佳硫酸铵浓度，除采用本讲义设计的操作程序之外，请你设计另一种工作程序测定盐析目的蛋白质的硫酸

33、铵最佳浓度，并指出两种方法的优缺点。a) 请你计算25时60%饱和度的硫酸铵溶液的离子强度。 实验六 凝胶过滤层析【目的】掌握凝胶过滤层析的基本原理；学习凝胶层析的操作技术，包括凝胶材料的选择、预处理、装柱、上样、洗脱、收集和样品的检测等；了解凝胶层析的应用如脱盐和浓缩、分子量测定、大分子量混合物的分离纯化等。【原理】凝胶层析是将样品混合物通过一定孔径的凝胶固定相，由于在层析过程中样品不同的蛋白质具有不同的洗脱，使不同的分子量的组分得以分离的层析方法。凝胶层析的分离过程是在装有多孔物质如交联聚苯乙烯、多孔玻璃、多孔硅胶、交联葡聚糖等填料的柱中进行的。填料颗粒含有许多不同大小的孔隙。这些孔隙对于

34、溶剂分子而言是很大的，他们可以自由扩散出入。对于溶质分子而言，如果分子大小合适时，则可以不同程度地往孔隙中扩散，大分子量的溶质分子只能占有较小的孔隙，而小分子量的溶质分子除能占住大孔隙外，还可以占有另外一些起更小的孔隙。所以随着溶质分子尺寸的减小，其占有孔隙体积迅速增加。当具有一定分子量分布的高聚物溶液从柱中通过时，由于溶质分子在孔隙中溶剂与颗粒溶剂之间进行扩散分配的差异造成较小的分子在柱中停留的时间比大分子停留的时间要长，所以整个样品按分子大小顺序而分开，最先洗脱出来是最大的分子。其定量关系符合以下公式：Ve=Vo+KV1Ve：某一溶质的洗脱体积Vo：层析柱的外水体积Vi：层析柱的内水体积K

35、：某一溶质的分配系数【试剂】(1) Sephadex G-75(2) 0.005M PBS(3) 兰色葡聚糖(4) 样品溶液【器材】 （1）带夹套层析柱：h=1:24（2）加样器 （3）分部收集器 （4）核酸蛋白检测仪 （5）小玻棒【操作步骤】（1）凝胶的选择和预处理本实验样品中含有分子量差异不大的多中组分，其中目的物为分子量60kd 的可溶性蛋白质，因此属大分子化合物的分离纯化，故选用SephadexG-75。对球形蛋白质而言，其排阻限为3000-70000。称取40g SephadexG-75，加入10倍以上吸液量的蒸馏水浸泡，在水浴加热时充分膨胀。（2）层析柱的选择对于大分子量化合物的分

36、级分离，要求柱床体积大于样品体积25倍以上，最高可达100倍，层析柱的径高比也在25-100之间。为了减少温度对分离蛋白质活性的影响，层析柱外加夹套，通入低温循环水，以保持低温。（3）凝胶柱的装填和凝胶床的检查将层析柱垂直固定，层析柱预装1/5的平衡溶液，再将适当浓度的凝胶悬液缓慢灌入层析柱中。灌胶前应打开柱端阀门，保持一定流速。灌装过程中，为防止管壁效应，边灌装边搅拌，使凝胶颗粒均匀沉降。对于装好的层析柱，先察看有无凝胶分层、沟流、气泡等现象。如果没有这些现象，就用2倍以上的柱床体积的洗脱液按正常操作流速过柱，以稳定柱床。加液前最好在床面上加上快速滤纸片，防止加液时冲动床面，破坏床面平整。为

37、了进一步检查凝胶柱的质量，通常用大分子有色物质溶液过柱，观察柱床有无断层、沟流，色带是否平整。常用0.2%-0.3%的兰色葡聚糖溶液（兰色葡聚糖分子量为2000kd），加入量为每平方厘米床面0.5-1.0毫升。同时也可测定层析柱的外水体积。兰色葡聚糖在260nm及610nm处各有一个吸收峰。（4）样品预处理及加样蛋白质样品浓度一般以不大于4%为宜，溶剂为洗脱液。如样品浑浊，应先过滤或离心除去颗粒后再上柱。将床面多余的洗脱液除掉，吸至离层析床面2厘米处为止。将出口打开，使床面的洗脱液流至1毫米，关闭出口。用加样器将样品加入床表面1厘米左右，再打开出口，使样品渗入凝胶内。样品加完后，用尽量少的洗脱

38、液洗涤表面1-2次。当样品完全渗入凝胶内后，再仔细加入洗脱液至离床面3-4厘米处，即可接上洗脱瓶进行层析。（5）洗脱与收集为了防止柱床体积的变化，造成流速降低及重复性下降，整个洗脱过程应始终保持一定的操作压。流速不能过快且要稳定。洗脱液的成分不应改变。洗脱液采用分部收集器收集，以核酸蛋白检测器检测洗脱峰。（6）层析柱再生层析柱在合理使用情况下一般无需再生即可多次重复使用。如长期使用会造成层析柱板结，不溶物污染及严重吸附等，影响流速或分离效果，因此需要再生。最简单的方法是用水反冲。（7） 目的蛋白检测【思考】1 制备型凝胶柱层析洗脱液检测与收集经常分流，为什么？2 SephadexG-75凝胶柱

39、操作压与流速控制在多大范围比较适宜？ 实验七 蛋白质免疫印迹实验（Western Blotting）【目的】了解蛋白质免疫印迹实验的基本原理，学会操作步骤，并能自行设计检测蛋白质的实验。【原理】 Western Blotting 是相对于核酸检测方法Southern Blotting、Northern Blotting 而命名得来的，它是用来检测蛋白质的一种技术。在这个技术中，首先将含有待测蛋白的蛋白质混合物进行凝胶电泳分离，然后将已经分离的蛋白质通过电泳技术从凝胶转移到固体支持物上，这一固体支持物目前常为硝酸纤维素薄膜。随后以待测蛋白质上抗原决定簇特异性的抗体（称为第一抗体）为探针，与固体支

40、持物上的蛋白质进行免疫反应，最后用偶联有辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶的抗第一抗体的抗体（第二抗体）与第一抗体进行免疫反应，只有与第一抗体特异性结合的待测蛋白才能与第二抗体发生免疫反应。在有辣根过氧化物酶的底物用显色剂存在时就会出现颜色反应，结合有第一抗体、第二抗体的待测蛋白，通过颜色反应即能显现出来。电泳将蛋白质从凝胶转移到固体支持物上是通过电转移仪器完成的。它是将固体支持物面对阳极、凝胶面对阴极，二者结合在一起，然后将外面二侧用Whatman 3MM滤纸结合，形成“三明治”结构，放入电转移仪器上，加入电泳缓冲液，通上电源后，蛋白质即可从凝胶上转移到固体支持物上。上面简要介绍了蛋白质免疫印迹实

41、验的基本原理。具体到本实验是为了前面实验所表达的GST-NS53 融合蛋白，所以本实验第一抗体为兔抗GST 蛋白质抗体，第二抗体为偶联有辣根过氧化物酶的羊抗兔免疫球蛋白抗体。【器材】电转移仪器恒温摇床硝酸纤维素薄膜Whatman 3MM滤纸电泳仪 裁纸刀 手表25cm培养皿 玻璃棒【试剂】电转移缓冲液 pH8.339mM甘氨酸4.8mM Tris碱0.037% SDS20% 甲醇混合2.9克甘氨酸，5.8克Tris,0.37克SDS,加200ml甲醇，定容到1000ml.封闭缓冲液：5%（W/V）脱脂奶粉溶于PBS中PBS: NaCl 8g,KCl 0.2g,Na2HPO4 1.44g,KH2

42、PO4 0.24g 加双蒸水800ml,用HCl调pH到pH7.4,再加水到1000ml,分装后，15磅20分钟灭菌。4-氯萘酚显色液：用30mg 4-氯萘酚（简称4-CN）溶于1ml无水乙醇中制成母液。将5014-CN对母液和5130%的H2O2加入到5ml 0.05M/L Tris-Cl(pH7.6)中。 氨基黑染色液：0.1%氨基黑10-B、45%甲醇、10%冰乙酸氨基黑脱色液：90%甲醇、2%冰乙酸、8%水【操作步骤和方法】1. 蛋白质电转移戴上手套，取下SDS-PAGE凝胶，小心剥离凝胶。裁剪与凝胶同样大的硝酸纤维素薄膜和六层Whatman 3MM滤纸，在硝酸纤维素薄膜左下角剪去一角

43、作为标记。将硝酸纤维素薄膜漂浮于去离子水的表面，使水从膜的下部浸透以去除其间气泡，将Whatman 3MM滤纸在电转移缓冲液中浸湿，用蒸馏水淋洗石墨电极，先将三层浸湿的滤纸放在阳极上，在滤纸表面滚动玻璃棒以除去其间的气泡，再将浸湿的硝酸纤维素薄膜小心平铺在滤纸上，用玻璃棒小心去除气泡。随后将12%SDS-PAGE凝胶舒展平铺在硝酸纤维素薄膜上，用玻璃棒小心去除气泡，再将三层浸湿的滤纸平铺在凝胶上，沁心去除气泡，最后加上石墨电极板，接通电源进行电转移，电流的大小由凝胶的大小决定，为0.65mA/平方厘米。电转移2小时后，停止通电，卸掉电转移装置，取下凝胶进行考马斯亮兰染色，以检测电转移是否完全。

44、小心取下硝酸纤维素薄膜，放在一张干滤纸上，吸干30-60分钟后，开始进显色反应。2. 显色反应首先进行分子量标记的氨基黑染色。切下转有分子量标记的硝酸纤维素薄膜，用含有0.3%吐温20的PBS缓冲液漂洗三次后（每次15分钟），再将其浸入氨基黑染液中，室温染色5分钟，然后置于氨基黑脱色液中脱去背景，水中漂洗后景干备用。转有样品的硝酸纤维素薄膜用含有5%脱脂牛奶的PBS缓冲液在室温下封闭2小时，同时1：100加入兔抗GST第一抗体，平缓摇动，室温保温1小时。然后用PBS缓冲液将硝酸纤维素薄膜漂洗4次，每次 30分钟。将辣根过氧分物酶标记的羊抗兔免疫球蛋白第二抗 体用封闭液稀释50倍后，加入吐温20至终浓度为0.05%，然后与上述漂洗的硝酸纤维素薄膜进行反应，将膜浸于其中，平放在平缓摇动的摇床平台上，室温温育 1小时后，用PBS缓冲液将硝酸纤维素薄膜漂洗4次，每次5分钟，再加入4-氯萘酚显色液，加入 51 的30%H2O2，将硝酸纤维素薄膜置于其中缓慢摇动，待所检测的蛋白带显色达到最深程度后，将硝酸纤维素薄膜转入