CyclinE、CyclinD1和P21WAFICIP1在喉癌癌变过程中表达及其临床病理意义

1、CyclinE、CyclinD1和P21WAFI/CIP1在喉癌癌变过程中表达及其临床病理意义摘要目的探讨喉癌癌变过程中CyclinE、CyclinD1和P21WAFI/CIP1表达的临床病理学意义。方法用免疫组化检测20例正常粘膜、40例不典型增生病变和60例喉癌组织中CyclinE、CyclinD1和P21WAFI/CIP1的表达。结果CyclinE、CyclinD1和P21WAFI/CIP1阳性表达定位于细胞核。在喉癌癌变过程中，喉正常粘膜、不典型增生病变和喉癌中CyclinE阳性表达率分别为：5.0%(1/20)，20.0%(8/40)，45.0%(27/60) (P0.001)；Cy

2、clinD1阳性表达率分别为：5.0%(1/20)，30.0%(12/40)，53.3%(32/60)( P0.001)；P21WAFI/CIP1阳性表达率分别为：95.0%(19/20)，75.0%(30/40)和63.3%(38/60) (P0.05)。P21WAFI/CIP1在高、中和低分化的喉癌中阳性表达率分别为：76.2%(16/21)，65.5%(19/29)和30.0%(3/10) (P0.05)；CyclinE、CyclinD1阳性表达与肿瘤细胞的分化无关。CyclinD1和P21WAFI/CIP1阳性表达显著相关，CyclinE与CyclinD1，CyclinE与P21WAF

3、I/CIP1表达无相关性。结论喉癌癌变过程中CyclinE和CyclinD1阳性表达率呈逐渐升高的趋势，而P21WAFI/CIP1阳性表达率呈逐渐降低的趋势。CyclinE和CyclinD1异常表达是喉癌发生中早期分子事件。P21WAFI/CIP1表达与喉癌细胞分化程度有关。细胞周期调控因子CyclinE、CyclinD1和P21WAFI/CIP1相互调控机制在喉癌发展中起重要作用。关键词喉癌；细胞周期蛋白E；细胞周期蛋白D1；P21WAFI/CIP1基因；免疫组织化学中分类号文献标识码A Clinicopathological significance of CyclinE、CyclinD1

4、 P21WAFI/CIP1 experssion in laryngeal carcinogenesisWANG Jian-bo，LOU Wei-hua，DONG Ming-min(Department of Otorhinolarygology,Jining First Peoples Hospital,Jining 272111)AbstractObjectiveTo investigate the clinicopathlogical significance of the CyclinE、CyclinD1 and P21WAFI/CIP1 expression in laryngeal

5、 carcinogenesis.MethodsThe expression of CyclinE、CyclinD1 and P21WAFI/CIP1 was examined by immunohistochemistry method in 20 cases of nomal epithlium,40 cases of dysplastic epithlium and 60 cases of laryngeal cancers.ResultsImmunoreaction of CyclinE、CyclinD1 and P21WAFI/CIP1 was localized in the nuc

6、lei of cells.In normal epithlium,dysplastic squamous epithlium and squamous cell carcinoma of the larynx,the positive immunostaining rate of Cycline protein was 5.0%(1/20),20.0%(8/40) and 45.0%(27/60) respectively (p0.001) ,of CyclinD1 protein was 5.0%(1/20),30.0%(12/40) and 53.0%(32/60) respectivel

7、y (P0.001) and of P21WAFI/CIP1 protein was 95.0%(19/20),75.0%(30/40) and 63.3%(38/60) respectively(P0.05).P21WAFI/CIP1 positive expression in highly、moderately and poorly differtiated carcinomas were 76.2%(16/21)、66.5%(19/29) and 30.0%(3/10) respectively(P0.05),P21WAFI/CIP1 protein expression was si

8、gnificantly associated with tumour cell differentiation.The positive expression of CyclinD1 closely related to the positive expression of P21WAFI/CIP1(P0.05).ConclusionsWith the development of lesions,the positive immunostaining rate of CyclinE and CyclinD1 protein increased,while the rate of P21WAF

9、I/CIP1WAFI/CIP1 expression was associated with tumour cell differentiation.The cell cycle regulators play an important role in the laryngeal carcinoma.Key wordslaryngeal neoplasms;CyclinE gene;CyclinD1 gene;P21WAFI/CIP1 gene;immnuohistochemistry喉癌如同所有肿瘤性疾病一样，其上皮细胞癌变机制不明。研究证实：细胞周期调控异常是肿瘤发生的内在原因，在细胞周期

10、中，G1/S的调控点是细胞内外信号经过传递、整合汇集到细胞核，对细胞的增殖进行调控的关键点，该点调控的异常与肿瘤的发生发展关系密切1。CyclinE和CyclinD1是G1/S转换的正性调控因子，P21WAFI/CIP1是负性调控因子。同时观察CyclinE、CyclinD1和P21WAFI/CIP1基因蛋白产物在喉癌癌变过程中的表达国内外尚未见报道。本研究以喉正常粘膜，喉粘膜不典型增生病变和喉癌为研究对象，采用免疫组化方法检测两种基因蛋白产物，观察在喉癌癌变过程中变化及相互关系，为进一步研究喉癌发生发展分子学基础提供有价值资料。材料和方法材料60例喉癌标本，喉粘膜不典型增生病变组40例，20

11、例正常粘膜。临床资料60例喉癌组，男性55例，女性5例，年龄4778岁(平均58岁)；按1992年UICC分型分期：声门上型18例，声门型31例，声门下型11例；T分期：T1 6例，T2 12例，T3 29例，T4 13例；临床分期：期5例，期7例，期37例，期11例。病理检查均为鳞状细胞癌，其中高分化21例，中分化29例，低分化10例。方法免疫组化染色采用SP法，鼠抗人SP试剂盒，兔抗人CyclinE(HE-12)鼠抗人单克隆抗体、CyclinD1(HD-11)单克隆抗体和鼠抗人P21WAFI/CIP1(4D-10)单克隆抗体均为Santa Cruz公司产品，购于北京中山生物技术有限公司。D

12、AB显色浓缩液购于郑州华美公司。免疫组化染色按SP法试剂盒提供说明进行，免疫组化检测设阳、阴性和空白对照。用SAS统计软件包进行统计分析。结果判定标准参考文献2，3，4确定本实验结果判断标准：CyclinE、CyclinD1和P21WAFI/CIP1阳性反应物均为棕黄色颗粒，定位于细胞核。以细胞核中出现棕黄色颗粒作为阳性细胞，根据阳性细胞数判断结果：阴性(-)：无阳性细胞或阳性细胞数5%，染色强度较浅；阳性(+)：阳性细胞数5%，染色强度中等以上。结果三种基因阳性细胞的表达三种基因蛋白产物阳性反应物均呈棕黄色颗粒。CyclinE、CyclinD1和P21WAFI/CIP1阳性表达以细胞核为主。

13、正常喉粘膜中CyclinE和CyclinD1各有一例表达阳性，染色较弱；P21WAFI/CIP1阳性细胞出现在上皮的中层，基底膜和表层细胞表达阴性。在喉不典型增生病变中，CyclinE、CyclinD1和P21WAFI/CIP1阳性细胞出现在上皮的中下层。喉癌中，CyclinD1阳性表达呈弥漫性分布，CyclinE和P21WAFI/CIP1阳性细胞呈散在分布。三种基因蛋白产物在喉癌癌变中的表达由表1可知：CyclinE和CyclinD1在喉正常粘膜、喉不典型增生病变和喉癌中阳性表达率呈逐渐升高的趋势，喉癌组明显高于对照组，组间比较有高度显著性差异(P均0.01)。P21WAFI/CIP1在喉癌

14、癌变过程中，阳性表达率呈逐渐降低的趋势，喉癌组明显低于对照组，组间比较有显著性差异(P0.05)。三种基因阳性表达与临床病理参数关系由表2可知：P21WAFI/CIP1在高、中和低分化的喉癌中阳性表达率呈逐渐下降的趋势，高分化组明显高于底分化组，组间比较有显著性差异(P0.05)。CyclinE、CyclinD1和 P21WAFI/CIP1阳性表达率与喉癌的性别，临床分型，T分型和临床分期无显著性差异(P均0.05)。三种基因阳性表达相关性分析由表3和4可知： 喉癌中 CyclinD1 和 P21WAFI/CIP1阳性表达显著相关(P0.05)。表1三种基因蛋白在喉癌癌变过程中的表达组织类型C

15、yclinE例(%)aP21WAFI/CIP1例(%)bCyclinD1例(%)c-+-+-+正常组191(5.0)119(95.0)191(5.0)不典型增生组328(20.0)1030(75.0)2812(30.0)喉癌组3327(45.0)2238(63.3)2832(53.3)a,x2=14.29,P0.001;b,x2=8.77,P0.05;c,x2=16.39,P0.001 表2喉癌中三种基因蛋白产物表达与临床病理参数的关系临床病理参数例数CyclinE例(%)aP21WAFI/CIP1例(%)bCyclinD1例(%)c-+-+-+性别男553025(45.5)3025(45.5

16、)2629(52.7)女532(40.0)23(60.0)23(60.0)分化高分化211110(47.6)516(76.2)a1011(52.4)程度中分化291514(48.3)1019(65.0)1415(51.7)低分化1073(30.0)73(30.0)46(60.0)临床声门上型18108(44.4)810(55.6)99(50.0)分型声门型311912(38.7)1120(64.5)1615(48.4)声门下型1147(63.6)38(72.7)38(72.7)T分期T1-218117(38.9)99(50.0)117(38.9)T3-4422220(47.6)1319(69.

17、1)1725(59.5)临床-1284(33.3)57(58.3)75(41.7)分期-482523(47.9)1731(64.6)2127(64.6)a2=6.34P0.05 表3喉癌中Cyclin D1与P21WAFI/CIP1、Cyclin E表达的相关性CyclinD1P21WAFI/CIP1例(%)aCyclinE例(%)b-+-+阳性组8241616阴性组14141117a 2=4.02P0.05 讨论一、CyclinE和CyclinD1基因蛋白表达与喉癌发生发展的关系CyclinE和CyclinD1是参与细胞周期G1/S转换的重要正性调节因子。它们过度表达使细胞周期G1/S转换时

18、间缩短，进而促进细胞周期的进程和细胞过度增殖，导致细胞癌变。研究表明：免疫组化法检测CyclinE和CyclinD1蛋白表达可以反映其基因的扩增和mRNA过表达的水平4，5。因此，通过免疫组化法探讨喉癌发生发展的不同阶段(正常不典型增生病变原发性肿瘤)，可有助理解CyclinE和CyclinD1在喉癌发生发展中的作用。本实验发现：喉癌癌变过程中CyclinE和CyclinD1阳性表达率呈逐渐升高的趋势，喉癌组明显高于对照组；CyclinE和CyclinD1蛋白表达不仅出现在肿瘤细胞，而且在不同程度的不典型增生病变中也有表达，并且CyclinE和CyclinD1阳性表达与喉癌细胞分化程度、临床分

19、型、T分期和临床分期无相关性；说明CyclinE和CyclinD1的阳性表达在一部分喉癌的发生过程中起重要作用。结果表明CyclinE和CyclinD1基因蛋白的表达可能是喉癌发生过程中一个较早的分子事件。与文献2，4报道一致。有学者在乳腺癌4，6、食管癌7和胃癌8中均发现CyclinE和CyclinD1基因的扩增出现在细胞癌变的早期，这就意味着CyclinE和CyclinD1基因有可能成为潜在的肿瘤诊断标志。在多种肿瘤中，CyclinE和CyclinD1过度表达的阳性率与其基因扩增率并不一致，Gausauge等9报道28例胰腺癌中25%存在DNA的扩增，mRNA的过度表达高达82%，Cycl

20、inD1蛋白表达率为64%。大肠癌中未发现明显的CyclinD1基因扩增，而CyclinD1阳性表达率为20%10；Akama8在胃癌研究中发现CyclinE基因扩增率约为15%，CyclinE蛋白阳性表达率为60%；卵巢癌中CyclinE基因扩增率为21%，mRNA过度表达率为29.5%11。结果表明CyclinE和CyclinD1基因扩增可导致其蛋白的过度表达，但不是其阳性表达的唯一机制，也可能存在转录后机制和翻译水平修饰。不论CyclinE和CyclinD1表达的机制如何，肿瘤中阳性表达具有恶性转化的潜力。本研究结果表明，CyclinE和CyclinD1异常表达在喉癌发生发展中可能起重要

21、作用。二、P21WAFI/CIP1阳性表达与喉癌癌变的关系P21WAFI/CIP1基因的生物学作用是直接参与细胞生长抑制、DNA复制、发育和分化等调控过程，与肿瘤的发生发展机制密切相关1。本实验中，P21WAFI/CIP1基因蛋白阳性表达率在喉癌癌变过程中呈逐渐降低的趋势，喉癌组明显低于对照组(P0.05)。由于P21WAFI/CIP1是一种至今罕见突变的肿瘤抑制基因，可认为免疫组化检出的P21WAFI/CIP1均有生物学功能，本实验结果提示P21WAFI/CIP1基因在喉癌癌变过程中，逐渐失去抑制细胞增殖，促进细胞分化功能，其蛋白表达水平的降低参与喉癌的发生。实验表明，P21WAFI/CIP

22、1阳性表达与肿瘤细胞分化有关1，3。本实验发现喉癌中，高、中和低分化组P21WAFI/CIP1阳性表达率随分化程度降低呈下降趋势，高分化组明显高于低分化组(P0.05)。表明P21WAFI/CIP1阳性表达与喉癌细胞分化程度有关，P21WAFI/CIP1能诱导喉癌中特异性基因表达，对于促进喉癌细胞分化，抑制细胞增殖起重要作用，与文献1，3结果一致。三、喉癌中三种基因阳性表达的相关性研究表明：DNA损伤因子导致P53表达增高，通过诱导其下游靶基因P21WAFI/CIP1的表达，抑制CyclinD1-CDK4/6复合物活性，反馈诱导CyclinD1的表达12。本实验发现CyclinD1与P21WA

23、FI/CIP1表达显著相关。说明：在喉癌发生发展过程中可能存在因P21WAFI/CIP1诱导CyclinD1表达途径，提示喉癌中CyclinD1阳性表达，除基因扩增外，P21WAFI/CIP1诱导途径也可能是其表达的重要机制之一。与在乳腺癌13的研究结果一致。本实验发现在喉癌发展中CyclinE和CyclinD1表达无相关性，与在卵巢癌11的研究一致；分析认为：CyclinE和CyclinD1同为G1期周期蛋白，CyclinE合成晚于CyclinD1，它们与其联手激活的CDK不同，CyclinD1与CDK4/6结合，CyclinE与CDK2结合。因此，它们可能通过不同作用途径调控细胞周期进程。

24、总之，在喉癌发展中细胞周期调控因子相互调控机制在喉癌演进过程中起重要作用。作者简介：王建波(1966-)，男，山东汶上人，硕士，主治医师。从事耳鼻咽喉专业。王建波(济宁市第一人民医院耳鼻喉科山东济宁 272111)韩月臣(济宁市第一人民医院耳鼻喉科山东济宁 272111)娄卫华(河南医科大学第一附属医院)董明敏(河南医科大学第一附属医院)参考文献1，Sherr CJ and Roberts JM.Inhibitors of mammalina G1 cyclindependent kinase.Genes Develop,1995;9:1149-11632，Fracchiolla SN,Pru

25、neri G,Pignataro L,et al.Molecular and immunohistochemical analysis of the bcl-1/cyclinD1 gene in laryngeal squamous.Cancer,1997;79:1114-1121WAFI/CIP1 expression is associated with cell differentition but not with p53 mutations in squamous cell carcinomas of larynx.J Pathol,1997;183;156-1634，ScottKA

26、,Walker RA.Lack of cyclinE immunoreactivity in nonmalignant breast and association with proliferation in breast cancer.Br J Cancer,1997;76(10):1288-12925，Capaccio P,Pruneri G,Carboni N.CyclinD1 protein expression is related to clinical progression in laryngeal squamous cell carcinomas.J Laryngol and Otol,1997;11:622-6266，Bartkova J,Lukas J,Strans M,et al.Cell cycle-related variation and tissue-restricted expression of human cyclinD1 protein.J Pathol,1994;172:237-2457，郑杰，候萍，周传农等.CDKN2 (P16INK4/MTS1)基因丢失和CyclinD1扩增在食管癌发生中的意义，中华肿瘤杂志，1996;18：408-4118，Akama Y,Yasui W,