Arg9人抗HBsAg单链抗体 EGFP融合蛋白基因的构建、表达及活性分析

1、Arg9/人抗HBsAg单链抗体/ EGFP融合蛋白基因的构建、表达及活性分析             作者：薛茜，温伟红，孟艳玲，张勇，张巍，王涛，张瑞，杨安钢 【关键词】  肝炎,乙型；肝炎表面抗原,乙型；ScFv；Arg9    BL21 and the percentages of them were 20% and 25% of total bacteria proteins respectively. Indirect ELISA c

2、onfirmed that the expressed products had antigen specific binding activity. CONCLUSION: The two fusion genes were constructed successfully. And the products of them expressed in E.coli BL21 maintained the binding activity to HBsAg.   【Keywords】 hepatitis B;  hepatitis B surface antige

3、ns;  ScFv;  Arg9   【摘要】  目的： 构建带有转膜结构域Arg9编码序列的R9/ScFv14/EGFP融合基因，将其转化入大肠杆菌中进行表达，并分析表达产物与HBsAg的结合活性.  方法： 设计引物，将Arg9的编码序列引入单链抗体基因的5端，PCR扩增后获得带有Arg9编码序列的ScFv14基因，将PCR产物连入pMD18T载体，进行序列测定. 将测序正确的ScFv14基因和R9/ScFv14基因分别与EGFP基因连接后转化入原核表达载体pET32a，获得ScFv14/EGFP和R9/ScFv14/EGFP两种

4、融合基因的表达载体，转化大肠杆菌BL21(DE3)LysS，以IPTG诱导表达，对表达产物进行SDSPAGE分析，并用间接ELISA方法检测其与HBsAg的亲和活性.  结果： 经酶切鉴定及测序证实ScFv14/EGFP融合基因和R9/ScFv14/EGFP融合基因序列完全正确.SDSPAGE分析表明两种融合基因在大肠杆菌BL21中成功获得表达，表达量分别占菌体总蛋白的20% 和25%.间接ELISA检测证实所表达的ScFv14/EGFP融合蛋白和R9/ScFv14/EGFP融合蛋白均具有HBsAg结合活性.  结论： 成功构建了带有转膜结构域Arg9编码序列的R9/ScF

5、v14/EGFP融合基因，并在大肠杆菌BL21中成功表达，表达产物ScFv14/EGFP和R9/ScFv14/EGFP均具有与抗原HBsAg特异性结合的活性.   【关键词】 肝炎，乙型；肝炎表面抗原，乙型；ScFv；Arg9   0引言   单链抗体（ScFv）是抗体重链可变区(VH)与轻链可变区(VL)通过一段连接肽(linker)连接而成的一种小分子抗体.其分子质量仅为完整抗体的1/6，不仅能较好地保持抗原结合能力，并且具有分子质量小、穿透力强、半衰期短、免疫原性低、制备流程简单等特点，更有利于体内应用1-3. 绿色荧光蛋白(g

6、reen fluorescent protein,  GFP) 是从水母中分离出来的一种发光蛋白,可在A450 nm490 nm的蓝光激发下发出绿色荧光，使用普通荧光显微镜即可进行观察.是近年来细胞生物领域中应用最为广泛的标记性蛋白质之一.EGFP为一种突变型GFP，所产生的荧光比野生型GFP增强，可作为标签用于检测目的蛋白及指示目的蛋白的定位. ScFv与效应分子组成的融合蛋白能否高效地内化入细胞对于其生物学功能的发挥具有非常关键的作用. Arg9是一个九聚精氨酸的短肽序列，是蛋白转膜结构域（PTDs）的一种，它能够将与之融合的蛋白携带入细胞内4. 我们将抗HBsAg的单链抗体（S

7、cFv14）基因5与EGFP基因融合，并将Arg9编码序列融合到ScFv14/EGFP基因的5端，构建带有转膜结构域Arg9的R9/ScFv14/EGFP融合蛋白基因，将它们在大肠杆菌中进行诱导表达，并对表达产物的亲和活性进行了分析.    1材料和方法  株和原核表达载体pET32a（第四军医大学生物化学与分子生物学教研室构建5并保存）；EGFP融合蛋白表达载体pEGFPN3（Clontech公司）；DNA Marker, T4 DNA Ligase, pMD18T vector和限制性内切酶BamH, EcoR, Not（TaKaRa公司）

8、；质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒（上海华舜公司）；Werstern blot 显影液（Pierce公司）.     1.2.1引物的设计与合成根据ScFv14基因序列，设计引物扩增ScFv14基因，并设计引物将Arg9的编码序列引入ScFv14基因的5端，引物序列   14F  5  TTTGAATTCATGGAGGTGCAGCTGGTGGAGTC 3；14R9F  5 TTTGAATTCATGAGACGCAGGAGACG   CAGGCGGAGACGGGAGGTGCAGCTGGTGGA

9、GTC 3； L3  5 TTTGGATCCTCGATTGATTTCCACCTTGGT 3. 其中划线部分为九聚精氨酸的编码序列.   1.2.2重组质粒的构建与鉴定以pUC19ScFv14为模板，分别以14F，L3和14R9F，L3为引物扩增ScFv14基因和R9/ScFv14基因.反应条件：95 35 s， 55 45 s，72和BamH进行酶切，得到ScFv14和R9/ScFv14基因片段，将pEGFPN3用BamH和Not条件下连接4 h后，再连入经EcoR和Not   1.2.3融合基因的诱导表达及鉴定将pET32aScFv14/EG

10、FP和pET32aR9/ScFv14/EGFP质粒分别转化入E .coli.BL21，挑取单克隆菌落接种于含有氨苄青霉素的LB培养基中，220 r/min，  37培养过夜，次日以1100转接，在220 r/min, 37条件下振荡培养至A600 nm=0.40.6,加入IPTG至终浓度为1 mmol/L,诱导培养3 h，取1 mL诱导菌液离心，收集菌体，进行SDSPAGE分析.另取5 mL诱导菌液离心，收集菌体，以0.2 mol/L的TrisHCl(pH=8.0)重悬，超声裂解后，离心取上清，沉淀用0.2 mol/L TrisHCl(pH=7.4)重悬，取上清和沉淀进行SDSPAG

11、E分析.   1.2.4重组融合蛋白的Western blot分析将诱导菌进行SDSPAGE 分离蛋白质，用半干式电转仪将凝胶中的蛋白质转移到硝酸纤维素膜（NC）上，经50 g/L的脱脂奶粉封闭1 h，用鼠抗EGFP mAb（11000稀释），4孵育过夜，用TBST洗膜6次，每次5 min,再加入辣根过氧化酶HRP标记的山羊抗小鼠IgG，室温孵育1 h, 用TBST洗膜6次，每次5 min,按显影液说明加入显影液，用化学发光法进行检测.   1.2.5融合蛋白亲和活性的ELISA检测用5 mg/L HBsAg包被ELISA板,每孔100 L, 4过夜.

12、加入不同稀释度的细菌裂解上清,每孔100 L, 37孵育1 h. 设空白和阴性对照. 洗涤后,加入鼠抗EGFP mAb（11000稀释）,37孵育1 h. 洗涤后再加入辣根过氧化酶HRP标记的山羊抗小鼠IgG, 37孵育1 h. 最后各孔加入新鲜配制的ABTS显色液100 L,  37孵育30 min,终止反应.以酶标仪测定各孔A410 nm值.            2结果   2.1目的基因扩增和酶切鉴定PCR产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳证实分别扩增出大小约

13、为750 bp和780 bp的条带(图1A) .测序结果证实扩增的ScFv14和R9/ScFv14基因完全正确. 用EcoR和BamH双酶切鉴定，得到大小约为750 bp和780 bp的条带，与预期长度相符（图1B）.  和BamH双酶切ScFv14和R9/ScFv14基因，分别得到大小约为750 bp和780 bp的条带；用EcoR和Not双酶切融合蛋白基因，分别得到大小约为1490 bp和1520 bp的条带,与预期长度相符（图2）.   2.3重组融合蛋白表达的鉴定和分析SDSPAGE分析显示，与未诱导菌相比，两种诱导菌在Mr约为73 ku处均有一

14、特异性蛋白条带，同预期的大小相符.经凝胶成像系统扫描显示，它们的表达量分别约占菌体总蛋白的 20%和25%（图3）. 取IPTG诱导后的菌液进行超声裂解，分别取其裂解上清和沉淀进行SDSPAGE分析，电泳结果显示两种目的蛋白均主要存在于诱导菌的裂解上清中（图4）.   2.4重组融合蛋白的Western blot分析在Mr约为73 ku处有一特异性蛋白条带(图5)，与SDSPAGE分析结果相符，说明该诱导蛋白为目的蛋白.   2.5融合蛋白亲和活性的ELISA检测间接ELISA检测结果显示表达的两种ScFv14/EGFP融合蛋白均能与HBsAg抗原特异性

15、结合 (图6), 二者相比，R9/ScFv14/EGFP 与HBsAg的亲和力稍大于ScFv14/EGFP与HBsAg，但不具有统计学意义（P0.05）. 2，4: 未诱导的pET32a和pET32aR9/ScFv14/EGFP的全菌蛋白质； 3，5：  IPTG 诱导的pET32a和pET32aR9/ScFv14/EGFP的全菌蛋白质. B1:  marker； 2，4:  未诱导的pET32a和pET32aScFv14/EGFP的全菌蛋白质； 3，5： IPTG 诱导的pET32a和pET32aScFv14/EGFP的全菌蛋白质.   3讨

16、论   天然Fv片段中VH和VL为非共价性结合，是抗体分子中保留抗原结合部位的最小功能片段.将VH和VL用一个小肽(linker)连接起来，即单链抗体. 单链抗体易与效应分子相连，与其他蛋白融合，可得到具有多种生物学功能的融合蛋白.近年来，以单链抗体为导向物的免疫融合蛋白在抗肿瘤、抗病毒等的治疗和诊断方面展现了广阔的前景，引起了人们的广泛关注.由单链抗体与毒素、酶、细胞因子等的基因相连的免疫融合蛋白，可以结合到特定的靶部位，高效的发挥生物学功能6-7 .   蛋白转膜结构域（PTDs）是一类能够介导与之融合的蛋白内化入细胞的短肽.它们作为内化的工具被广泛

17、应用，它不仅可以使多肽、多聚核苷酸、极小微粒进入细胞，甚至可以在体内介导蛋白质的内化8 . Futaki等9发现多种富含精氨酸的肽都具有转膜作用.在比较了不同长度的多聚精氨酸对内化效率的影响之后，他们发现八聚精氨酸（Arg8）的内化效果最好  . Wender等10发现Arg9具有更高效的内化作用.我们采用转膜结构域Arg9来增强融合蛋白的转膜功能，以期使产物具有更高的内化效率.     【参考文献】   1 Kasuya K, Boyer JL, Tan Y, et al.  Passive immunother

18、apy for anthrax toxin mediated by an adenovirus expressing an antiprotective antigen singlechain antibody J. Mol Ther, 2005,11(2):237-244.   2 Neve RM, Nielsen UB, Kirpotin DB, et al.  Biological effects of antiErbB2 single chain antibodies selected for internalizing function J. Bioch

19、em Biophys Res Commun, 2001,280(1):274-279.   3 Rosana B, Michel  M,  Jules Mattes.   Intracellular accumulation of the antiCD20 antibody 1F5 in Blymphoma cells J. Clin Cancer Res, 2002,8(8):2701-2713.   4  Hea D,  Yangb H,  Lina Q, et al. 

20、  Arg9peptide facilitates the internalization of an antiCEA immunotoxin and potentiates its specific cytotoxicity to target cells  J. Int J Biochem  Cell Biol, 2005,37(1):192-205.   5 Wen WH, Zhao J, Yu CJ, et al. Construction of singlechain Fv Gene of AntiHBsAg and its expression in COS7 cells J . Chin J Cell Mol Immunol, 2003,19（2）:163-167.   6  Schnell R, Vitetta E, Schindler J, et al. Treatment of refractory Hodgkins lymphoma