HPLC法测定注射用胸腺肽α1的含量

1、HPLC法测定注射用胸腺肽1的含量        【摘要】  目的：改进注射用胸腺肽1含量测定的方法。方法：色谱柱为Luna C18( 5m ，4.6mm×250mm)；流动相A为0.05mol/L磷酸二氢钾缓冲液(pH5.7)乙腈(928)，流动相B为乙腈，梯度洗脱，流速为1.0 mL/min ；检测波长为210nm；柱温为室温；进样量20L。结果：胸腺肽1在0.050.8mg/mL 范围内具有良好的线性关系，r = 0.9999，平均回收率为99.4%。结论：改进后的方法操作简单，省时，重复

2、性好，进一步完善了产品的质量标准。 【关键词】  高效液相色谱法；注射用胸腺肽1；含量测定ABSTRACT Objective: To improve the content determination method for thymopetidum 1  injection. Methods：Content of 20L thymopetidum injection was determined by high performance liquid chromatography (HPLC) instrument fixed with a Luna C18 (5 m ,4

3、.6 mm×250mm). The mobile phase A was water with 0.05 mol/L KDP (pH5.7) and AN（928）, mobile phase B was AN, and gradient elution was used. The flow rate was 1.0 mL/min, detective wavelength was 210 nm and column temperature was room temperature. Results：The linear range for content of thymopetid

4、um 1 injection was 0.050.8 mg/mL, r=0.9999, the average recovery was 99.4%. Conclusion：The improved determination method is simple, timesaving with good repeatability, and can help to improve the quality standards of injective thymopetidum.    KEY WORDSHigh performance liquid chromato

5、graphy (HPLC)；Thymopetidum 1 injection；Content determination    注射用胸腺肽1主要成分为胸腺肽1，是化学合成的28肽，临床用于慢性乙型肝炎和作为免疫损害病者的疫苗免疫应答增强剂。在2010年版药典二部中收录的注射用胸腺肽1标准1和国家食品药品监督管理局颁布的药品试行标准（YBH26822005）中规定的含量测定方法，梯度洗脱时间较长，操作繁琐且重复性较差。本实验对注射用胸腺肽1含量测定方法进行了改进，现报道如下。1  试药与仪器1.1  试药    胸

6、腺肽1对照品及注射用胸腺肽1（海南某药品研发公司提供），对照品含量：99.78%，乙腈为色谱纯，磷酸二氢钾为分析纯。1.2  仪器     Agilent 1100 高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；DAD二极管阵列检测器（美国安捷伦公司）。2  实验方法与结果2.1  色谱条件与系统适用性试验    色谱柱：Luna C18 ( 5m ，4.6mm×250mm)；以0.05mol/L磷酸二氢钾缓冲液(pH5.7)乙腈(928)为流动相A，乙腈为流动相B，采用梯度洗脱，在8min之内流

7、动相B由3%增加到9%，在2min之内流动相B降为3%，并平衡5min，检测波长为210nm，进样量20L，理论板数按胸腺肽1峰应大于5000。2.2  测定方法      余邦良等.HPLC法测定注射用胸腺肽1的含量  取本品适量，用0.05mol/L磷酸二氢钾缓冲液(pH6.8)溶解，制成1mL中约含胸腺肽1 0.1mg的溶液，作为供试品溶液（临用前配制），精密量取20L，注入液相色谱仪，参照高效液相色谱法2，记录色谱图；另精密称取胸腺肽1对照品适量，用0.05mol/L磷酸二氢钾缓冲液(pH6.8)溶解，制成1mL中约

8、含胸腺肽1 0.1mg的溶液，作为对照品溶液（临用前配制），同法测定，按外标法以峰面积计算，其平均含量应符合规定。2.3  辅料干扰试验    按处方量精密称取甘露醇、氢氧化钠，并另取注射用胸腺肽1，按“2.2项”制成辅料溶液和供试品溶液，分别取20L注入液相色谱仪，按含量测定法记录色谱图（图1、2），从图谱上可以看出, 这些辅料在主峰吸收处均无吸收，故不影响注射用胸腺肽1含量的测定。图1  空白辅料色谱图图2  注射用胸腺1色谱图2.4  回收率试验    称取按处方量计算的辅料9份，分别加入

9、标示量80%、100%、120%的胸腺肽1，每种标示量各3份样，分别置相应的量瓶中，按“2.2项”制成供试品溶液，按含量测定方法，记录色谱图，计算其回收率。平均回收率为99.4%，RSD为0.25%。2.5  精密度试验     取同一批号的注射用胸腺肽1 6瓶，按“2.2项”制成供试品溶液，按含量测定方法，每个供试品溶液平行测定6次，记录色谱图，主峰面积的RSD为0.34%。1         2.6  配液稳定性试验   

10、  取注射用胸腺肽1适量，按“2.2项”制成供试品溶液，将其放置在2025的室温下，分别于配样后第0、2、4、8、12h取样按含量测定方法分析，主峰面积的RSD为0.54%，结果表明供试品溶液在12h内较稳定。2.7  线性试验    取注射用胸腺肽1适量，按“2.2项”制成1mL中约含胸腺肽1 1mg的溶液，并分别稀释成含胸腺肽1 0.8、0.4、0.2、0.1、0.05 mg/L 的溶液，按含量测定方法测定，记录色谱图，以进样浓度X（mg/L ）为横坐标，胸腺肽1峰面积积分值Y为纵坐标，绘制标准曲线。其线性方程为：Y=18980X+1348

11、0433，r=0.9999。线性范围0.050.8mg/L。2.8  样品含量测定    取注射用胸腺肽1 8瓶（1.6mg/瓶），各瓶精密加入0.05mol/L磷酸二氢钾缓冲液(pH6.8)1.6mL溶解，合并，精密吸取5mL置50mL量瓶中，稀释至刻度，制成1mL中约含胸腺肽1 0.1mg的溶液，作为供试品溶液（临用前配制），精密量取20L，注入液相色谱仪，按高效液相色谱法2，记录色谱图；另取经五氧化二磷干燥至恒重的胸腺肽1对照品适量，同法测定，按外标法以峰面积计算其平均含量。3批样品含量分别为100.9%、100.1%、100.2%。  3  讨论    原法 “YBH26822005” 的含量测定的梯度洗脱，在20min内流动相B由0增加到9%，然后在1min内流动相B降为0，并用流动相A平衡10min。经试验发现该法耗时长，且重现性差。本文对其梯度洗脱法进行修改：在8min之内流动相B由3%增加到9%，在2min之内流动相B降为3%，并平衡5min。    通过方法