MyD88在OK432诱导树突状细胞成熟中的作用

1、MyD88在OK432诱导树突状细胞成熟中的作用         10-11-15 11:40:00     编辑：studa20                 作者：倪秀雄 刘丽燕 刘永建 曾真 袁明洲 陈玄【摘要】  目的 探讨小鼠骨髓树突状细胞(DCs)髓性分化蛋白88(MyD88)在OK432诱导D

2、Cs 成熟中的作用机制。 方法 分离小鼠骨髓单核细胞(BMMCs)，在含10%胎牛血清、重组小鼠粒巨噬细胞集落刺激因子(rmGMCSF)、重组小鼠白细胞介素4(rmIL4)的培养体系中诱导培养，所得的细胞即为DCs。于培养的第5天，将细胞分为3组：对照组不加OK432和MyD88 siRNA;OK432组加入终浓度为5 g/mL的OK432;RNA干扰组加入MyD88 siRNA 12 h后，再加入5 g/mL OK432刺激。半定量RTPCR法检测DCs中MyD88的表达;ELISA法检测各组DCs分泌肿瘤坏死因子(TNF)和IL12的能力;MTT法检测DCs体外刺激同种混合淋巴细胞增殖的免

3、疫活性。 结果 OK432组DCs的MyD88高表达、TNF和IL12释放明显增加并能诱导较强混合淋巴细胞反应，而用MyD88 siRNA干扰后以上效应均降低(P<0.05)。 结论 靶向MyD88 siRNA可明显抑制小鼠DCs中MyD88的表达和OK432诱导的DCs成熟，表明MyD88介导OK432诱导的DCs成熟。 【关键词】  树突状细胞; RNA，小分子干扰; 毕西巴尼; 免疫耐受           树突状细胞(dendritic cells，DCs)是目前所知的体

4、内功能最强的抗原提呈细胞(antigenpresenting cell，APC)，能够显著刺激初始T细胞进行增殖，并具有激活免疫应答和诱导免疫耐受双重功能。OK432作为GMP级免疫调节剂可安全、有效地提高恶性肿瘤患者的生存率。Kanzaki等研究发现，OK432与常用的DCs成熟诱导剂脂多糖(LPS)、肿瘤坏死因子(TNF)相比，刺激健康人外周血单个核细胞来源的未成熟的DCs成熟的能力更强14。Toll样受体(Tolllike receptors，TLRs)及其信号转导途径在调控DCs的成熟过程中起重要作用5，而髓样分化因子88(myeloid differentiation factor

5、88，MyD88)是TLRs信号转导途径中关键的衔接分子。在前期实验中，笔者采用OK432联合肿瘤细胞冻融抗原已成功的诱导了小鼠骨髓源性DCs的成熟6，但其信号途径尚不清楚。本实验采用RNA干扰技术抑制小鼠骨髓DCs中MyD88的表达，进一步证实MyD88在OK432诱导DCs成熟中的作用。1 材料和方法1.1 材料 雄性SPF级615小鼠，68周龄大连医科大学实验动物中心，许可证号：SCXK(辽)20040017;RPMI1640干粉培养基(美国GIBICO公司);胎牛血清(FCS,杭州四季青生物工程材料有限公司);重组小鼠白细胞介素4(rmIL4，美国R&D公司);重组小鼠粒巨噬细

6、胞集落刺激因子(rmGMCSF，美国R&D公司);OK432(20081001，山东鲁抗制药公司);红细胞裂解液(139.6 mmol/L NH4Cl、16.96 mmol/L Tris用1 mol/L HCl调pH至7.2);MyD88 siRNA、RNAimate(上海吉玛制药技术有限公司);Trizol(美国Invitrogen公司);逆转录试剂盒(#K1621， MBI Ferments公司);PCR MasterMix(北京天跟生化科技有限公司);MyD88引物(上海生物工程公司);ELISA试剂盒(美国R&D公司);MTT粉(美国Sigma公司)。1.2 方法1.2

7、.1 获取骨髓前体细胞 小鼠颈椎脱臼处死，无菌取双侧股骨和胫骨。去除附着的肌肉和结缔组织，剪掉骨两端，用PBS液冲洗骨髓腔，制成骨髓细胞悬液，200目尼龙网过滤，离心弃上清，110的体积比加入37 预温的红细胞裂解液，反复吹打混匀，室温5 min，PBS离心洗涤2次，用含10%FCS的RPMI 1640完全培养液调整细胞浓度为2×106 mL-1，接种于6孔板，培养孵育2 h，吸去悬浮细胞，获得的半贴壁细胞即骨髓单核细胞(bone marrow mononuclear cells, BMMCs)6。1.2.2 体外DCs的诱导培养和分组 将贴壁的BMMCs置于含10% FCS、GMC

8、SF(1 000 IU/mL)、IL4(500 IU/mL)的RPMI 1640完全培养液中,37 、体积分数为0.05的CO2条件下继续培养所得细胞即为DCs，分别于第3，5天各全量换液1次并补加细胞因子。于第5天时将细胞分3组：(1)对照组：培养过程中不加OK432和MyD88 siRNA;(2)OK432组：加入终浓度为5 g/mL的OK432;(3)RNAi组：加入12 h后给予OK432 5 g/mL刺激。3组细胞继续培养48 h。1.2.3 MyD88 siRNA转染 MyD88 siRNA序列为：5GAC UGA UUC CUA UUA AAU Att35UAU UUA AUA

9、GGA AUC AGU Ctt3于500 L的无血清培养基中稀释5 g siRNA，加入15 g RNAimate试剂，37 温育30 min使复合物形成;将复合物加入含DCs的6孔板中,终体积为2 mL7;继续培养48 h，收集各组DCs及上清。1.2.4 半定量RTPCR分析MyD88的表达 用Trizol分别提取3组细胞总RNA，琼脂糖凝胶电泳鉴定其完整性，紫外分光光度计定量及纯度检测。总RNA经逆转录试剂盒合成cDNA，PCR扩增MyD88基因。引物合成如下：MyD88(185 bp)：正义链: 5'CACTCGCAGTTTGTTGGATG3'反义链: 5'CC

10、ACCTGTAAAGGCTTCTCG3'内参照GAPDH(496 bp)：正义链: 5'CAAGGTCATCCATGACAACTTTG3反义链: 5'GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG3MyD88，GAPDH的PCR反应条件如下：94 5 min94 30 s52 30 s72 1 min，32个循环;最终延伸72 5 min。PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像系统摄像分析，根据目的基因PCR产物与GAPDH基因PCR产物灰度比来判断靶基因的mRNA被siRNA沉寂的程度。1.2.5 ELISA法检测DCs产生的细胞因子 收集第7天的各组DCs上清，严

11、格按ELISA试剂盒说明操作，每组设3个复孔，结果取3孔均值。1.2.6 混合淋巴细胞反应(alloMLR) 取小鼠的脾脏，制备脾细胞悬液，裂解红细胞获得单个核细胞，用含10% FCS RPMI 1640培养孵育2 h，收集悬浮细胞即为同种异体淋巴细胞，调整浓度为1×106 mL1作为靶细胞置于96孔板(每孔100 L)。收集各处理组的DCs分别加入丝裂霉素C(50 mg/mL)处理30 min，作为效应细胞。分别以效靶比(E/T)为11、110、1100加入，终体积为200 L，每组设3个复孔，并分别设空白孔和单纯的淋巴细胞对照孔，培养3 d，与培养结束前4 h加入MTT液(5 mg/mL，每孔20 L)继续孵育4 h，离心弃上清