MLC20磷酸化在PKCα、PKCε调节失血性休克大鼠血管钙

1、    MLC20磷酸化在PKC、PKC调节失血性休克大鼠血管钙敏感性中的作用徐竞,杨光明,李涛,明佳,陈玮,张瑗,刘良明(第三军医大学大坪医院野战外科研究所第二研究室,创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室,重庆400042)摘要:目的观察肌球蛋白轻链(MLC20)磷酸化在蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)、蛋白激酶C(proteinkinase C, PKC)调节大鼠失血性休克后血管钙敏感性中的作用,进一步探讨休克血管钙失敏的发生机制。方法采用缺氧大鼠血管平滑肌细胞(vascular smoothmuscle cel,l VSMC)和

2、失血性休克后大鼠肠系膜上动脉(superiormesenteric artery,SMA),运用Western blot、底物磷酸化等技术方法,观察PKC、PKC激动剂作用下,以及抑制CPI-17、ILK、ZIPK后再给予PKC、PKC激动剂时,肌球蛋白轻链磷酸酶(myosin light chain phosphatase,MLCP)活性和MLC20磷酸化的变化。结果缺氧2 h后VSMC中MLCP活性增高至正常对照的150. 1% (P<0·01), PKC、PKC激动剂可显著抑制其增高,使其分别降低至正常对照的103. 0%和96. 3% (P<0·01),

3、抑制CPI-17、ILK、ZIPK,可显著抑制PKC激动剂降低MLCP活性的作用,使其分别增高至正常对照的136. 7%、127. 6%和116. 7% (P<0·01);抑制CPI-17、ILK、ZIPK,也可显著抑制PKC激动剂降低MLCP活性的作用,使其分别增高至134. 0%、128. 5%和126. 0% (P<0·01)。失血性休克2 h后SMA中MLC20磷酸化水平由32. 4%显著降低至10. 4% (P<0·01), PKC、PKC激动剂可显著抑制其降低,使其分别增高至26·4%和25. 6% (P<0·

4、;01),抑制CPI-17、ILK、ZIPK,可显著削弱PKC激动剂的增高MLC20磷酸化的作用,使其分别降低至12. 7%、10·0%和15. 7% (P<0·01);也可显著削弱PKC激动剂增高MLC20磷酸化的作用,使其分别降低至10. 1%、12. 5%和10. 3% (P<0·01)。结论PKC、PKC可能通过CPI-17、ILK、ZIPK调节MLCP活性和MLC20磷酸化,调节失血性休克血管平滑肌的钙敏感性。关键词:钙敏感性; PKC; PKC;MLCP;MLC20中图法分类号:R363;R345. 57;R605. 971文献标识码:AR

5、ole ofMLC20phosphorylation in PKCand PKCregulating calcium sensitivity incultured hypoxic VSMCs and in hemorrhagic shock ratsXU Jing,YANG Guang-ming,LITao,MING Jia,CHENWei,ZHANG Yuan,LIU Liang-ming(State Key Laboratory ofTrauma,Burns and Combined Injury,Department 2,Institute of Surgery Research,Dap

6、ingHospital,Third Military medicalUniversity,Chongqing 400042,China)Abstract:ObjectiveTo observe the role of20 kDamyosin light chain(MLC20)phosphorylation in theregulation ofprotein kinase C(PKC)and PKCon calcium sensitivity during hemorrhagic shock(HS)inrats for themechanism ofcalcium desensitizati

7、on.MethodsVascular smoothmuscle cells(VSMCs)afterhy-poxia and superiormesenteric artery(SMA)from HS rats were adopted to observe the effects of PKCandPKCagonists on the activity ofmyosin light chain phosphatase(MLCP)and the phosphorylation ofMLC20,and observe the influence of inhibitors ofPKC-potent

8、iated inhibitory protein forprotein phosphatase 1 of17 kDa(CPI-17),integrin-linked kinase(ILK)and zipper-interacting protein kinase(ZIPK)on the action ofPKCand PKCagonists in these events byWestern blotting and substrate phosphorylation.Results(1)MLCPactivitywas increased to 150. 1% ofnormal control

9、group inVSMC after2 h hypoxia(P<0·01),andwas de-creased to 103. 0%(P<0·01)or 96. 3%(P<0·01)by PKCagonist or PKCagonis.t Comparing withPKCagonistgroup,MLCP activitywas increased to136. 7%(P<0·01),127. 6%(P<0·01)and 116. 7%(P<0·01)after the treatmentof t

10、he inhibitors ofCPI-17,ILK and ZIPK respectively. Comparingwith PKCagonistgroup, MLCP activitywas increased to 134. 0% (P<0·01), 128. 5% (P<0·01) and 126. 0% (P<0·01) respectively by the inhibitors ofCPI-17, ILK and ZIPK. (2)MLC20phosphorylationwas decreased from32. 4% to 10.

11、 4% (P<0·01) in SMA after2 h shock, andwas increased to 26. 4% (P<0·01) and 25. 6%(P<0·01) byPKCand PKCagonists. ComparingwithPKCagonistgroup, MLC20phosphorylationwasde-creased to 12. 7% (P<0·01), 10·0% (P<0·01) and 15. 7% (P<0·01) respectively by

12、 the inhibitors ofCPI-17, ILK and ZIPK. Comparingwith PKCagonistgroup, MLC20phosphorylationwas decreased to 10. 1%(P<0·01), 12. 5% (P<0·01) and 10. 3% (P<0·01) respectively by the inhibitors ofCPI-17, ILK andZIPK.ConclusionPKCand PKCmay regulate theMLCP activity andMLC20phosp

13、horylationviaCPI-17,ILK and ZIPK, tomodulate calcium sensitization ofvascular smoothmuscle followingHS.Key words:calcium sensitivity; protein kinase C; protein kinase C; myosin light chain phosphatase;20 kDamyosin light chain严重创伤、休克后血管平滑肌细胞(vascularsmoothmuscle cel,l VSMC)钙失敏,即肌肉收缩蛋白对钙的敏感性降低,力/钙比率降低

14、1,是继VSMC肾上腺素能受体失敏2、膜超极化3之后发现的失血性休克血管低反应性的又一重要发生机制。本实验室前期研究发现蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)、蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)可通过调节下游分子17×103的蛋白激酶C依赖的磷酸酶抑制剂protein kinaseC (PKC)-dependentphosphates inhibitorof17 kDa, CPI-17、整合素链结激酶( integrin-linkedkinase, ILK)、Zipper相互作用蛋白激酶(Zipper-inter-acting protein

15、kinase, ZIPK)的表达和活性,来调节血管钙敏感性和血管反应性。CPI-17、ILK、ZIPK是目前已知的几种可通过调节肌球蛋白轻链磷酸酶(myosinlight chain phosphatase,MLCP)活性,进而调节肌球蛋白轻链MLC20磷酸化,引起平滑肌钙敏感性改变和平滑肌收缩的重要分子。在失血性休克血管平滑肌,PKC、PKC是否通过这些分子影响MLCP活性和MLC20磷酸化来调节休克血管钙敏感性,尚不清楚。本实验采用失血性休克大鼠肠系膜上动脉(superiormesenteric artery, SMA)和缺氧VSMC,运用Westernblot、底物磷酸化等技术方法,观察

16、PKC、PKC激动剂作用下,以及抑制CPI-17、ILK、ZIPK后再给予PKC、PKC激动剂时,MLCP活性和MLC20磷酸化的变化,分析PKC、PKC是否通过CPI-17、ILK、ZIPK调节MLCP活性和MLC20磷酸化,以调节休克后血管钙敏感性,以进一步了解休克血管钙失敏的发生机制,为寻找有效的休克血管敏感性和血管舒缩反应性调节靶点和防治药物提供实验依据。1材料与方法1. 1VSMC缺氧培养、失血性休克模型制作及实验分组取培养到第46代的VSMC,实验当日将培养的VSMC用无血清的DMEM-F12培养基换液,去盖后移入缺氧培养罐内,以10 L/min流量充入缺氧气体(95% N2, 5

17、% CO2)10 min,夹闭5 min,反复3次,达到完全缺氧后开始计时,夹闭2 h后即为缺氧2 h的VSMC,并以0·05 mmol/L-escin、0·01 mmol/LA-23187于37孵育10 min蜕膜后,用于测定MLCP活性。分组为:缺氧2 h组、PKC激动剂组(缺氧2 h后,加入1×10-7mol/L thymelea toxin孵育10 min)、PKC激动剂组(缺氧2 h,加入4×10-6mol/L卡巴胆碱孵育10 min)、CPI-17抑制剂+PKC激动剂/PKC激动剂组(缺氧2 h后,以1800的稀释度加入CPI-17抗体孵育1

18、0 min,再加入PKC激动剂或PKC激动剂孵育10 min)、ILK抑制剂+PKC激动剂/PKC激动剂组(缺氧2 h后,以1500的稀释度加入ILK抗体孵育10 min,再加入PKC激动剂或PKC激动剂孵育10 min)、ZIPK抑制剂+PKC激动剂/PKC激动剂组(缺氧2 h后,以1600的稀释度加入ZIPK抗体孵育10 min,再加入PKC激动剂或PKC激动剂孵育10 min)。另取正常VSMC蜕膜后用作测定MLCP活性的正常对照组。清洁级Wistar大鼠30只,雌雄各半,体质量(230±20.6) g,由本所实验动物中心提供。戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后,右侧股动脉插管接血压计,

19、其中27只大鼠放血使平均动脉压(MAP)降至40 mmHg。维持2 h后活杀大鼠取SMA,并以0·05 mmol/L-escin、0·01 mmol/L A-23187于37孵育10 min蜕膜后,用于测定MLC20磷酸化,另外3只大鼠不放血休克,取SMA并蜕膜用作MLC20磷酸化测定的正常对照组。实验分组及各组处理同1. 1。1. 2MLCP活性测定1. 2. 1Myosin磷酸化蛋白的准备取250l Myosin(7.8mg/ml)加入500l磷酸化反应液(组成:Na2HPO42 mol/L,MgCl20. 5 mol/L, CaCl22 mol/L, EDTA 10

20、mmol/L, DTT20 mmol/L)及10l CaM ( 0. 1 mmol/L)、10l MLCK(1 mg/ml)、10l ATP (100 mmol/L)、10l Microsystin-LR(100mol/L)、10l -32P-ATP(20 mmol/L), 25水浴1. 5 h;将反应混合液移入透析袋中,封闭,以10倍体积的透析液(组成:Na2HPO4100 mmol/L, EDTA 1 mmol/L, DTT 1 mmol/L)透析, 4, 12 h,备用。1. 2. 2MLCP活性测定取褪膜并按各组要求处理好的VSMC,加入100l蛋白提取液组成: Tris 50 mmo

21、l/L, NaCl150 mmol/L,Triton X-100 1% (体积分数), EGTA 1 mmol/L,EDTA 2 mmol/L, NaF 10 mmol/L, Na3VO41 mmol/L, PMSF19731 mmol/L,Leupeptin 5g/m,l Aprotinin 5g/m,l-巯基乙醇11 000, -70放置10min后冰上裂解1. 5 h, 4、8 000×g离心10 min,取上清即为所需蛋白,并蛋白定量。取上述蛋白10,l加入240l蛋白稀释液(组成: Tris-HCl 25 mmol/L,EDTA 0. 1 mmol/L,-巯基乙醇0. 1%

22、 ),混匀, 25放置3 min;取40l蛋白稀释液,加入10l磷酸化Myosin, 25反应15 min;加入100l 25%三氯乙酸, 25l 5 mg/ml牛血清白蛋白,冰浴10 min终止反应; 13 000×g,离心3 min;取100l反应混合液滴于滤纸片上,用78 mmol/L PBS洗涤10 min, 4次,吹干后放入液闪瓶中,加入6 ml闪烁液(含5% PPO、0·03%POPOP的二甲苯),测定液体闪烁计数值(cpm)。同时取10l磷酸化Myosin测定cpm值,以从磷酸化肌球蛋白脱去的磷表示MLCP活性(单位pmol·min-1·m

23、g-1)。1. 3MLC20磷酸化水平测定将各组SMA褪膜并按各组要求处理后,将血管浸入预冷的丙酮中(含10%三氯乙酸和10 mmol/L DTT), -70冻存2 d。取出-70冻存的血管样本,室温放置1 h,用含10 mmol/LDTT的丙酮洗涤2次,室温干燥3 h。再加入100l尿素蛋白提取液(组成: Tris base 20 mmol/L,甘氨酸22mmol/L, DTT10 mmol/L,尿素8. 0 mol/L,溴酚蓝0. 1% ),充分混匀,室温下振荡3 h; 4, 15 000×g离心30 min,取上清即为所需蛋白。接着配制10%甘油胶,先以400 V电压预电泳1

24、h,加样后以400 V电压继续电泳,直至溴酚蓝跑出胶底部,停止电泳,将凝胶转移硝酸纤维素膜, 5%脱脂奶粉封闭1 h后,加入MLC20抗体(1200 ), 4过夜,再用辣根过氧化物酶标记二抗(110 000),室温温育1 h,化学发光法胶片成像。MLC20磷酸化水平采用磷酸化MLC20占MLC20蛋白的百分比表示。1. 4统计学处理采用SPSS 10. 0统计软件对计量资料行t检验。2结果2. 1PKC、PKC以及CPI-17、ILK、ZIPK对缺氧VSMC中MLCP活性的作用与正常对照组相比,缺氧2 h的VSMC中MLCP活性显著增高,达到正常对照组的150. 1% (P<0·

25、;01);与缺氧2 h组相比, PKC和PKC的激动剂可显著降低MLCP活性,使其分别降低至正常对照组的103. 0% (P<0·01)和96. 3% (P<0·01);与PKC激动剂组相比, CPI-17、ILK、ZIPK的抑制剂又可显著增高MLCP活性,使其分别增高至正常对照组的136·7% (P<0·01)、127. 6% (P<0·01)和116. 7% (P<0·05);与PKC激动剂组相比, CPI-17、ILK、ZIPK的抑制剂也可显著增高MLCP活性,使其分别增高至正常对照组的134. 0

26、% (P<0·01)、128. 5% (P<0·01)和126. 0% (P<0·01)(图1)。2. 2PKC、PKC以及CPI-17、ILK、ZIPK对休克大鼠SMA中MLC20磷酸化的影响与正常对照组相比,失血性休克2 h后SMA中MLC20磷酸化显著降低,由32. 4%降低至10. 4% (P<0·01);与休克2 h组相比, PKC和PKC的激动剂可显著增高MLC20磷酸化,使其分别增高至26. 4% (P<0·01)和25. 6% (P<0·01);与PKC激动剂组相比, CPI-17、

27、ILK、ZIPK的抑制剂可显著降低MLC20磷酸化,使其分别降低至12. 7% (P<0·01)、10·0% (P<0·01)和15.7% (P<0·01);与PKC激动剂组相比,CPI-17、ILK、ZIPK的抑制剂也可显著降低MLC20磷酸化,使其分别降低至10. 1%(P<0·01)、12.5% (P<0·01)和10.3% (P<0·01,图2)。3讨论严重创伤/休克患者失代偿期常出现血管低反应性,主要表现为全身血管对缩血管物质和舒血管物质的反应降低或不反应,是血压不能有效提升,组

28、织灌注不良,加重细胞缺氧和损伤,最终导致多器官功能障碍综合征(MODS)和多器官功能衰竭(MOF)的重要原因之一4, 5,现有研究表明休克血管低反应性的发生可能与肾上腺素能受体失敏、VSMC膜超极化、钙失敏(即血管平滑肌细胞肌肉收缩蛋白对钙的敏感性降低)等因素有关1-3。PKC、PKC通过调节CPI-17、ILK、ZIPK的表达和活性,来调节失血性休克血管钙敏感性和血管反应性,但在CPI-17、ILK、ZIPK的这些分子之后的信号转导途径如何,尚不清楚。根据基础研究,血管平滑肌细胞的收缩主要取决于MLC20的磷酸化程度,而MLC20磷酸化又由MLCK和MLCP共同调节,MLCK由Ca2+-Ca

29、M复合物激活,为钙离子浓度依赖性的调节途径,而MLCP可由一系列分子作用下活性受抑,导致MLC20磷酸化和血管平滑肌收缩,为钙离子浓度非依赖性的调节途径,也就是钙敏感性调节途径。CPI-17、ILK、ZIPK是目前已知的几种非钙依赖性平滑肌收缩的调节分子,在失血性休克后, PKC、PKC是否通过CPI-17、ILK、ZIPK,调节MLCP的活性和MLC20磷酸化,来调节血管钙敏感性,尚少见文献报道。本实验采用失血性休克大鼠SMA和缺氧培养的VSMC,运用Western blot、底物磷酸化等技术方法,观察PKC、PKC激动剂作用下,以及抑制CPI-17、ILK、ZIPK后再给予PKC、PKC激

30、动剂时,MLCP活性和MLC20磷酸化的变化。结果显示抑制CPI-17、ILK、ZIPK后,可显著抑制PKC、PKC激动剂的降低缺氧VSMC中MLCP活性,增高MLC20磷酸化的作用。提示PKC、PKC可能通过CPI-17、ILK、ZIPK调节MLCP活性和MLC20磷酸化,以调节休克后的血管钙敏感性。除本实验外,还有大量研究表明, CPI-17、ILK、ZIPK可通过调节MLCP活性,调节MLC20磷酸化水平,从而调节平滑肌舒缩状态。CPI-17可在PKC作用下发生Thr-38位点磷酸化,从而引起构象变化,使其与MLCP的催化亚基结合而抑制MLCP6。ILK也与钙离子非依赖性的平滑肌收缩有密

31、切关系,除磷酸化CPI-17外7,还可直接磷酸化MLCP的肌球蛋白靶向亚基(myosin-targeting subuni,t MYPT-1 )从而抑制MLCP8,以及直接磷酸化MLC20的Ser18、Thr19位点,引起平滑肌收缩9。ZIPK除磷酸化CPI-17外10,还可像ILK一样,直接磷酸化MYPT-1和MLC20,导致平滑肌收缩11, 12。本实验研究结果与其相符合。然而,在失血性休克血管反应性和钙敏感性调节信号转导系统中,PKC是否直接作用于CPI-17、ILK和ZIPK,这3个分子之间的关系又如何,是否存在相互作用,尚需进一步研究。参考文献:1 Xu J, Liu L. The

32、role of calcium desensitization in vascularhyporeac-tivity and its regulation afterhemorrhagic shock in the ratJ. Shock,2005, 23(6): 576-581.2刘良明,胡德耀,陈惠孙.循环休克肾上腺素能受体失敏研究进展J.中国病理生理杂志, 1998, 14(1): 100-103.3刘杰,赵克森.重症休克大鼠细动脉平滑肌膜电位变化在血管反应性降低中的作用J.中国病理生理杂志, 1998, 14(1): 39-42.4江其生,胡德耀,肖南,等.失血性休克大鼠血管平滑肌收缩

33、功能变化研究J.中国病理生理杂志, 2002, 18(11): 1425-1426,1446.5 Liu LM,Ward JA, DubickM A. Hemorrhage-induced vascularhypo-reactivity to norepinephrine in selectvasculatures of rats and roles ofni-tric oxide and endothelinJ. Shock, 2003, 19(3): 208-214.6 Kitazawa T, EtoM, WoodsomeTP,etal. Phosphorylation of themyo-sin phosphatase targeting subunit an