SLE 相关基因 IFIT1 免疫调节功能的初步研究

1、SLE 相关基因 IFIT1 免疫调节功能的初步研究    【摘要】  目的：研究系统性红斑狼疮（SLE）相关基因 IFIT1 的功能。方法：首先将 IFIT1 从穿梭表达克隆转入真核表达克隆，然后转导进入 Jurkat 细胞系，用有限稀释法筛选单克隆；再用 CD3 和 CD28 刺激单克隆，检测膜分子的表达、细胞凋亡、增生、细胞因子分泌等免疫生物学指标；最后应用 RNAi 技术，下调 IFIT1 的表达，检测细胞因子分泌，比较分析 IFIT1 的功能。结果：IFIT1 的过度表达在 T 细胞中能诱导白细胞介素 IL-4 和 IL-10 的分泌

2、增加，下调 IFIT1 的转录水平后能部分下调 IL-4 和 IL-10 表达，而与细胞膜分子的表达、细胞的增生、凋亡无关。结论：SLE 相关新基因 IFIT1 在细胞因子的产生中起了重要作用，可能与 Thl/Th2 的失衡有关。 【关键词】  系统性红斑狼疮；IFIT1；细胞因子；基因干预    AbstractObjective     To  study  the  function  of  IFIT1,  a  novel 

3、gene  associated  with  the  systemic  lupus erythematosus  (SLE).    MethodsFirst  an  expression  clone  of   IFIT1  was  generated  by  performing  an  LR recombination  reaction  be

4、tween  the  entry  clone  from  Genecopoiea  and  a  GatewayTM  destination  vector. Then  the  vector  was  transfected  into  the  Jurkat  T  cells.  Single  clone  cells  expressing&

5、#160; EGFP  and  IFIT1-EGFP  were  selected  by  standard  limiting  dilution  method.  The  stable  transfectants  of  EGFP  and  IFIT1-EGFP were  stimulated  with  anti-CD3  and  anti-CD28.

6、0; Cell  surface  antigen  expression  were  detected  by  flow cytometry.  The  apoptosis  and  expansion  of  each  transfectant  were  detected  according  to  the  manufacture's  instruct

7、ion.  The  culture  supematants  were  assayed  for  cytokines  by  sandwich  ELISA.  Furthermore  transfection of  gene  silence  vector  which  could  produce  anti-IFIT1-specifics  small  RNA&

8、#160; duplexes  partially  blocked the  expression  of  overexpressed  IFIT1  in  Jurkat  T  cel1.  The  same  assays  were  done  by  stimulation  with anti-CD3  and  anti-CD28.    Res

9、ultsThere  were  no  significant  difference  in  the  expression  level  of  the  various cell  surface  molecules,  apoptosis  and  expansion  among  Jurkat,  Jurkat/EGFP,  and  Jurkat/IFIT1-EG

10、FP  transfectants. But  it  was  found  that  the  Jurkat/IFIT1-EGFP  could  enhance  the  production  of  IL-4  and  IL-10.  After  knocking down  the  expression  of  IFIT1  by  RNAi,

11、  the  levels  of  IL-4  and  IL-10  production  were  partially  decreased.ConclusionThe  results  indicate  the  SLE  related-gene  IFIT1  may  play  an  important  role  in  the 

12、; production  of cytokines  and  may  interfere  in  the  Th1/Th2  balance.    Key  WordsSystemic  lupus  erythematosus;  IFIT1;  Cytokines;  Gene  interfere     系统性红斑狼疮（Systemic Lupus Eryth

13、ematosus, SLE）是由遗传、性激素、感染、环境等因素相互作用所致的一种多层次免疫功能异常的自身免疫性疾病。大量研究证实，基因水平的免疫调节障碍及细胞因子代谢紊乱在 SLE 中表现突出，直接或间接地参与了 SLE 的形成和发生发展过程。近年来，随着基因分析技术的不断发展和相关研究的深入，一些 SLE 相关基因不断浮出水面，其中尤以 IFIT1 备受关注。有证据表明 IFIT1 在 T 细胞经 CD3/CD28 激活的信号传导通路中参与了细胞因子合成的调控，在 SLE 进程中起着举足轻重的作用1，2。本研究拟通过建立稳定过表达 IFIT1 的转染 T 细胞系，采用基因干预技术（RNAi）

14、下调 IFIT1 的表达，检测有关免疫学指标，进一步阐明 IFITI 在 T 细胞中的功能。    1    材料与方法    1.1    主要试剂和仪器    1.1.1    主要试剂    抗 CD3/CD28 单克隆抗体、PE 交联免疫细胞膜分子系列抗体、Percp 交联抗小鼠 Ig 抗体、细胞因子（IL-2、IL-4、IL-10、IFN-）、Annexin V-FITC 凋亡

15、检测试剂盒、细胞增生检测试剂盒、RNAi 试剂盒及质粒抽提试剂盒购自晶美公司；Jurkat 细胞、IFIT1 的穿梭表达克隆和GatewayTM 表达质粒 pcDNA-DEST47 由中科院细胞库提供。    1.1.2    主要仪器    BD 公司的 FACSAria-TY2640 型全自动流式细胞仪、Amaxa 公司的电转导仪和 Biod 公司的全自动 iCYCLE 型荧光 PCR 定量分析仪。    1.2    Jurkat 稳定转染

16、细胞系的建立    将 IFIT1 的穿梭表达克隆与 Gateway 表达质粒 pcDNA-DEST47 同时经兼容性的 LR 酶切，将 IFIT1 转入 pcDNA-DEST47，混合物转化入DB3.1TME.coli，经氨苄青霉素和氯霉素筛选阳性表达菌株，扩增培养后抽提质粒；同时制备仅表达 EGFP 的 pcDNA-DEST47 质粒，作为对照。采用电转导仪，分别将质粒 pcDNA/EGFP 和 pcDNA/IFIT1-EGFP 电转导入 Jurkat 细胞，48 h 后，加 G418 至终浓度 1200   g/mL，2 周后再经有限稀释

17、筛选表达 EGFP 和 IFIT1-EGFP 蛋白的克隆细胞株 J/EGFP 和 J/IFIT1-EGFP，经荧光显微镜观察和定量 PCR 验证所得克隆为稳定表达细胞株，同时冻存细胞株备用。所用 IFIT1 的引物由深圳匹基公司合成，Forward：5-GCCTCC TTTGGG TTCGTCTATAA-3，Reverse：5-TCAAAGTCAGCAGCCAGTCTCA -3。    1.3    免疫生物学功能指标的检测    用 CD3 和 CD28 分别刺激克隆细胞株 Jurkat、Jurkat/

18、EGFP 和 Jurka IFIT1-EGFP 后，进行下列免疫生物学功能指标的检测。    1.3.1    流式细胞仪检测细胞膜分子的表达    采用固相细胞刺激法，将 CD3（1   g/mL）和 CD28（2   g /mL）包被至 24 孔 Costar 板中，4 孵育 8 h，每孔加入含 1×106 个细胞的 500   L 培养液，37，5% CO2 培养 3 d，细胞培养液经离心，留上清液检测细胞因子。细胞沉淀经洗涤和单

19、抗染色处理后上流式细胞仪检测膜分子的表达。    1.3.2    细胞因子的定量检测    细胞培养液上清液细胞因子（IL-2、IL-4、IL-10、IFN -）的检测严格按照试剂操作说明书进行。    1.3.3    细胞增生功能的检测    采用非放射性染料 CSFE 标志核酸的方法，分别将 3 种细胞株调整至 6×106 个/mL，快速加入 5 nm 的 CSFE 1   L，

20、混匀后加至包被 CD3（1   g/mL）和 CD28（2   g/mL）的 Costar 板中，每孔 300   L，37，5% CO2 培养 96 h 后，上流式细胞仪检测。    1.3.4    细胞凋亡的检测    制备含 10-4 mol/L 地塞米松的培养液，用该液将 3 种细胞株调整至 l×l06 个/mL，每孔 1 mL，加至 24 孔 Costar 板中，37，5% CO，培养 7 h 后，按 Annexm V-FITC 凋亡检测试剂说明书操作，上流式细胞仪检测。    1.4    RNAi 的初步应用    1.4.1    有效靶序列的选择    从 GeneBank 中查到人的 IFIT1 的基因编码全