串联重复核定位信号的绿色荧光蛋白融合载体的构建与原核表达.

1、【摘要】目的：构建绿色荧光蛋白-串联重复核定位信号融合蛋白的表达载体(HisEGFP 3xNLS，并在原核细胞中进行表达与纯化。方法：采用PCR方法从原先克隆在pEGFP C1载体中的3xNLS与 EGFP编码序列扩增 出来，使用常规酶切和连接方法将其重组至pET 14b载体中，对阳性克隆进行酶切、PCR和测序鉴定。转化BL21(DE3)大肠杆菌株，用IPTG诱导融合蛋白 表达，并利用NiNTA亲和层析纯化该融合蛋白。结果： 构建的His EGFP3xNLS融合蛋白表达载体是正确的，该载体可在大肠杆菌内高效表达，用NiNTA纯化获得了相对分子质量约36 kD的融合蛋白。结论： 成功构建了 Hi

2、s EGFP 3xNLS融合蛋白表达载体，并在原核细胞中获得了高效表达和纯化， 为进一步研究NLS介导信号分子入核提供了实验材料。【关键词】核定位信号 载体蛋白质类 基因表达 蛋白纯化Abstract Objective: To con struct the expressi on vector of HisEGFP 3xNLS fusi on protein and obta in its expressi on and purificati on in E. coli. Methods: 3xNLS and EGFP seque nee wasamplified by PCR from p

3、EGFP C1 3xNLS vector and clo ned into pET14b vector followi ng the rout ine procedures. After ide ntificati on by en zyme digesti on, PCR and seque ncing, the positive clones were tran sformed into BL21 (DE3) compete nt cells, and the expressi on of His EGFP 3xNLS fusi on protein was in duced with I

4、PTG and further purified by NiNTA affinity chromatography. Results: Thecon structed HisEGFP 3xNLS fusi on protein vector highly expressedin E. coli. With NiNTA affin ity chromatography, a purified Hisfusi on protein with relative molecular mass of approximately 36 kD was obta in ed. Con clusi on: Th

5、e expressi on vector of HisEGFP 3xNLSfusi on prote in is con structed, expressed and purified un der non den aturi ng con diti ons, which may sig nifica ntly facilitate future study of the mecha nism by which NLS mediate the nu clear tran slocati on of certa in sig nal molecules.Key words nuclear lo

6、calization signal; carrier proteins; gene expressi on; prote in purificati on信号转导的时空特征，即信号蛋白的亚细胞定位(subcellular localization )和激活后移位(translocation)已成为目前细胞信号转导研究的热点领域1，2，信号分子的特异性亚细胞定位有助于细胞高效经济地完成 各种正常生理功能和病理反应。在刺激诱导的多种不同信号分子的移位入核过 程中，核定位信号(nuclear localization signal, NLS )都扮演着重要的角 色24，但目前NLS与核孔复合体(nu

7、clear pore complex, NPC )的相互作 用介导信号分子入核的具体机制仍未完全阐明。本实验构建了与增强型绿色荧 光蛋白(enhan ced green fluoresce nt prote in, EGFP)融合的 3 个串联重复的NLS融合蛋白原核表达载体，为研究 NLS介导信号分子入核的机制提供了一 个重要的工具。1 材料和方法1.1 质粒带有三个串联重复的NLS(3xNLS增强型绿色荧光蛋白载体 pEGFP C1 由挪威Troms大学Seternes教授馈赠，该质粒中3xNLS的序列为 aggaagaggaagctgctgaggaagaggaagctgctgaggaag

8、aggaagctg ctg，利用Hind III和Pst I克隆在pEGFP C1中。将质粒转化大肠杆菌株 DH5x，提取质粒DNA用DNA/RN定量仪测定DNA浓度，置-20 C保存备用。 pET14b质粒和大肠杆菌株 BL21(DE3)由本室保存。1.2 主要试剂QIAprep Spin Miniprep Kit和 NiNTA亲和树脂是 QIAGEN公司产品，限制性内切酶(Nde I、BamH I)、T4 DNA连接酶和Pyrobest高保真DNA聚合酶 购自 TaKaRa公司，100 bp 和 1 kb DNA ladder 分别是 Toyobo 公司和 Stratagene公司产品，异

9、丙基-B -D-硫代半乳糖(isopropyl B D thiogalactoside, IPTG )购自Sigma Aldrich 公司，引物由英骏公司合成。1.3 His EGFP 3xNLS融合载体的构建见图1。从pEGFP C13xNLS载体中扩增EGFP和 3xNLS所用的上游引物序列为5' tacatat gatggtgagcaagggcgaggagct3'，其中下划线部分是EGFP基因编码序列的第123位碱基；下游引物序列为5' taggatccttacgggcccgcggtaccgtcgactgca3 '，其中下划线部分是添加的终止密码子及pEG

10、FP C1载体上BamH I位点前的25位碱基的反向互补序列。用 Pyrobest 高保真聚合酶进行 PCR反应(95 C 30 s, 55 C 30 s,72 C 60 s，共30个循环)，扩增片段大小为 848 bp。将PCF产物用Nde I和BamH I 酶切，随后与Nde I和BamH I双酶切并电泳切胶回收的pET 14b连接，将连 接反应混合物转化大肠杆菌株 DH5x。挑取单菌落接种于Amp的 LB培养基中， 37 °C振摇过夜。取 5 ml菌液用QIAprep Spin Miniprep Kit 小量提取质粒 后，用Nde I和BamH I酶切鉴定。另外使用上述引物对重

11、组体进行PCR鉴定。酶切及PCF鉴定产物用1.2 %琼脂糖凝胶电泳，并在凝胶图像分析仪上成像。 重组体最终经测序鉴定无误后，置-20 C保存备用。1.4 His EGFP 3xNLS融合蛋白的原核表达及纯化将阳性重组质粒转化大肠杆菌株 BL21(DE3)。挑取单菌落，置于2 ml LB(Amp+)培养基中，37 C振摇培养至D600约为0.6时，加入终浓度为0.1 mmol/L的IPTG诱导，继续振摇3 h。利用12 % SDS PAGE来鉴定表达融合蛋 白的菌落。对有His EGFP 3xNLS融合蛋白表达的菌落进行大量(100 ml) 菌液扩增诱导，6 000 X g、4 C离心10 mi

12、n ;将细菌沉淀重悬于4 ml结合缓 冲液(300 mmol/L NaCl, 50 mmol/L NaH2PO4, 10 mmol/L 咪唑,0.1% TritonX 100, pH8.0 )中，超声破碎，15 000 X g, 4 C离心15 min。将上清加入 100卩l NiNTA亲和树脂中4 C孵育1 h，然后用1 ml的洗涤缓冲液(300mmol/L NaCl, 50 mmol/L NaH2PO4, 20 mmol/L 咪唑,pH8.0 )洗 NiNTA亲和树脂3次；最后用洗脱缓冲液(300 mmol/L NaCl, 50 mmol/L NaH2PO4, 250 mmol/L咪唑,p

13、H8.0 )洗脱蛋白后，12% SDS PAGE鉴定结果。2 结果 2.1 His EGFP 3xNLS融合载体的鉴定电泳结果表明有约0.85 kb和4.7 kb两个条带，符合插入片段的大小(图2A)。用特异性引物进行PCF反应扩增出约0.85 kb的条带，也符合预计结果（图 2B）。测序结果（用 T7 promoter primer 和 T7 term in ator primer双向测通）证实插入到pET 14b载体中的目的片段是正确的。2.2 His EGFP 3xNLS融合蛋白在大肠杆菌中的诱导表达和纯化经IPTG诱导后，细菌裂解液在约36 kD处形成一条浓密的蛋白条带，与预 期的Hi

14、s EGFP 3xNLS融合蛋白大小一致。利用Ni NTA亲和层析法对细 菌裂解液进行纯化后，在约36 kD处得到一条唯一的蛋白条带（图3）。3 讨论许多信号通路激活的最终结果都可引起细胞的基因表达发生改变，这通常 需要在信号通路被激活时，该级联中的某种蛋白从细胞质移位到细胞核中，通 过作用于其下游底物引起特异性的基因转录。真核细胞可以通过多种机制迅速 诱导蛋白质从胞质移位入核5。影响蛋白质在胞质和胞核中分布主要包括两个 因素，即与核转运机器或锚定蛋白的相互作用6，7。对于某种信号蛋白而 言，如果其分布于胞质中，且核输入速率低于核输出速率，那么当其与输入受 体-输入素的结合增加，与输出受体-输

15、出素的结合降低，或两者同时存在时将 迅速移位入核8。蛋白进出细胞核都必须通过 NPC小于50 kD的分子能通过核孔自由扩散 进出核，而大一些的分子则需要一个 NLS4。NLS般具有如下特征：（1）长 度一般小于20个氨基酸；（2）在蛋白入核内后不被移除；（3）通常富含带正 电的（碱性）氨基酸。除此之外，NLS之间不存在一致的序列9。核输入过程 可分为三个步骤。首先，位于胞质中的货物（需要移位入核的蛋白质，具有 NLS或与具有NLS的蛋白质结合）与输入素结合，形成的货物-输入素复合体， 随后被靶向到NPC上。移位过程需要小分子量 GTP酶Ran GTP的参与和生理温 度，目前该过程的具体机制尚未

16、阐明。入核后，货物-输入素复合体在RanGTP与输入素结合后解离。货物在核中被卸下，而输入素返回到胞质中进行下 一轮的转运。因而，NLS对于蛋白质移位入核具有重要作用4。研究表明， p38调节/激活蛋白激酶/MAPK激活蛋白激酶5移位入核依赖于其C末端的 NLS10。Seternes等利用三个串联重复NLS序列与EGFP融合的真核表达载体证实 了 p38通过与其下游底物MK5的结合和对其的激活来参与其核-胞质分布的调控 11。为了研究NLS在介导蛋白质入核中的确切机制（例如通过某些抑制剂的 使用），实验中选取一个典型的单个 NLS核心序列（RKRKL）构建了 EGFF融合 的原核表达载体，然而

17、该载体表达的His EGFP NLS融合蛋白加入细胞后并不能入核，说明融合蛋白内的单个 NLS可能在空间上被掩盖。结合 Seternes等 的结果，使用三个串联重复的 NLS来构建与EGFP融合的原核表达载体，该载体 经鉴定正确后，在大肠杆菌中进行了表达，获得了纯化的His EGFP 3xNLS融合蛋白，这为进一步研究NLS在介导蛋白质入核中的作用机制奠定了基础。【参考文献】1Teruel MN, Meyer T. Tran slocati on and reversible localizatio n of sig nali ng prote ins: a dyn amic future f

18、or sig nal tran sductio n J. Cell, 2000（2） :181-184.2 Cyer MS. Regulati on of nu clear localizati on duri ng sig nali ngJ. J Biol Chem, 2001(24):20805-20808.3 张琳，姜勇，张璐.p38蛋白激酶不同亚型在 RAW264.7细胞中的定位 J.第一军医大学学报，2000(3):193-196.4 龚小卫，姜勇.MAPK勺细胞内定位与激活后移位机制J.生物化学与生 物物理进展，2003:509-513.5 Seter nes OM, Joha n

19、sen B, Hegge B, et al. Both binding andactivati on of p38 mitoge nactivated protein kin ase (MAPK) playesse ntial roles in regulati on of the nu cleocytoplasmic distributio nof MAPK activated protein kin ase 5 by cellular stress J. Mol Cell Biol, 2002(20):6931-6945.6 Rout MP, Aitchis on JD. The nu clear pore complex as a tran sport machi ne J. J Biol Chem, 2001(20):16593-16596.7 New L, Jia ng Y, Han J. Regulation of PRAK subcellular location by p38 MAP kin ases J. Mol Biol Cell, 2003(6) :2603-2616.8 Waldma nn I, Walde S, Kehle nbach RH. Nuclear import of cJunis mediated by multiple tran sport