甘油三酯和极低密度脂蛋白对肝星状细胞增殖的影响

1、    甘油三酯和极低密度脂蛋白对肝星状细胞增殖的影响        【摘要】 目的 探讨甘油三酯（triglyceride, TG）和极低密度脂蛋白（very low-density lipoprotion, VLDL）对大鼠肝星状细胞(hepatic stellate cell, HSC)增殖的影响。方法 用链霉蛋白酶和胶原酶原位灌流，Nycodenz密度梯度离心分离大鼠HSC，并以MTT比色法观察TG和VLDL对HSC增殖效应。结果 TG和VLDL可影响HSC的增殖，T

2、G和VLDL浓度分别在12.5mg/L和(25100)mg/L时对HSC增殖有促进作用（P<0.05或P<0.01）。结论 体外细胞培养表明，TG和VLDL可促进HSC增殖，其与脂肪肝肝纤维化的发生可能有关。【关键词】 肝星状细胞 甘油三酯 极低密度脂蛋白增殖EFFECT OF TRIGLYCERIDE AND VERY LOW-DENSITY LIPOPROTEIN ON PROLIFERATION OF HEPATIC STELLATE CELLS Lu Lungen, Zeng Minde, Li Jiqiang, et al. Shanghai Institute of D

3、igestive Disease, Renji Hospital, Shanghai Second Medical University, Shanghai 200001【Abstract】 Objective To study the effect of triglyceride(TG) and very low-density lipoprotein(VLDL) on proliferation of hepatic stellate cells(HSC). Methods HSCs were isolated and cultured from liver of wistar rats

4、by in situ perfusion with pronase and collagenase and density gradient centrifugation with Nycodenz. MTT colorimetric assay was detected for HSC proliferation.Results TG and VLDL had an effect on proliferation of HSC. TG and VLDL in concentration of 12.5mg/L and (25100)mg/L respectively promoted HSC

5、 proliferation(P<0.05 or P<0.01). Conclusion TG and VLDL promote HSC proliferation and may be associated with fatty liver and hepatic fibrogenesis.【Key words】 Hepatic stellate cell Triglyceride Very low-density lipoprotein Proliferation观察甘油三酯(triglyceride, TG)，极低密度脂蛋白(very low-density lipoprot

6、ein, VLDL)对肝星状细胞(hepatic stellate cell, HSC)增殖的影响，以探讨脂质在脂肪肝肝纤维化中对HSC的作用及其机制，为脂肪肝肝纤维化的防治提供理论依据。材料与方法一、实验动物Wistar雄性大鼠，体重400450g，购自上海实验动物中心，普通饲料喂养，自由进食。二、HSC的分离按文献1并加以改进，大鼠经腹腔静脉麻醉后，门静脉插管输入无Ca2+灌注液，同时剪断下腔静脉放血，灌注30min后，小心分离肝脏待肝组织软化后，剪碎，酶消化振荡30min过200目网后，滤液离心（450g）7min，弃上清液，沉淀物以12的体积与18%(W/V)的Nycodenz(Sig

7、ma)混匀，上覆少许DMEM(Gibco)培养液，行密度梯度离心(1450g)17min，离心后取界面处细胞，用DMEM清洗一次，离心（450g）7min，取沉淀细胞悬浮于含20%小牛血清的DMEM中，台盼蓝染色判断存活率并计算产率。三、HSC培养细胞以1×105/cm2接种于培养皿，置5%CO2、95%空气培养箱中（37）, 24h细胞贴壁后换液，以后隔34d更换一次培养液。四、HSC鉴定新分离的HSC悬液点涂片，置于荧光显微镜328nm波长紫外光照射下，细胞呈现蓝绿色自发荧光，兔抗人Desmin(DM)爬片作SP免疫组织化学（SP kit购自福州迈新公司）染色示胞浆阳染者为HSC

8、。五、MTT比色法2原代培养的细胞长满单层后用胰酶消化后置20%小牛血清的DMEM培养液中，调整细胞数为1×108/L，以每孔100ml加入96孔培养板内。置CO2培养箱内预培养72h后，分组并分别加入VLDL（南京医科大学动脉硬化中心提供）和TG(Sigma)，每组设5个复孔，VLDL终浓度(mg/L)分别为6.25, 12.5, 25, 50, 100; TG(mg/L)为12.5, 25, 50, 100, 200, 400。作用48h后，每孔加入5g/L的MTT（购自上海华顺公司）液20ml，振荡后继续孵育4h，后用酶标仪(E-Liza Mat-3000)双波长测定其OD值，

9、测定波长为570nm，参考波长为630nm, 酶标仪所示OD值为OD570减去OD630，以消除非特异性光吸收效应。结 果一、 HSC的得率和纯度每份肝HSC得率为(0.51)×107，以0.4%台盼蓝染色，细胞存活率在98%以上。原代培养的HSC DM阳性在90%以上，传代培养后HSC DM阳性在98%以上。二、TG对HSC增殖的影响TG 12.5mg/L 对HSC有增殖作用(P<0.05)，而25mg/L、50mg/L、100mg/L和200mg/L对HSC无影响（P>0.05），但400mg/L对HSC增殖有抑制作用(P<0.01)，见附表。三、VLDL对HS

10、C增殖的影响VLDL 6.25mg/L和12.5mg/L对HSC增殖无明显影响（P>0.05），但随着浓度增大，25mg/L、50mg/L和100mg/L的VLDL则促进HSC增殖（P<0.05或P<0.01），见附表。结 论肝纤维化是肝脏细胞外基质异常生成和积累的结果，肝细胞、Kuffer细胞、内皮细胞等均参与肝纤维化形成，但以HSC作用最重要，后者的激活增殖是各种原因引起肝纤维化形成的中心环节3。HSC表面有脂蛋白受体，胞浆富含脂滴，并能合成分泌载脂蛋白，提示它与肝细胞共同参与脂质代谢和转运4，而脂肪肝是肝内脂质转运和代谢紊乱引起TG在肝组织蓄积所致。近来一些研究5表明，

11、早期脂肪肝阶段，肝组织炎症、坏死不明显或缺乏时，HSC即已激活，其细胞内维生素A含量虽减少，但脂滴含量增多，约50%的脂肪肝伴有程度不一的中央静脉周围纤维化。Vicehte等6研究了HSC中脂质的代谢，HSC能产生或连接脂蛋白脂肪酶至其细胞表面，能分解脂蛋白核心成分的甘油三酯和外源性的甘油三酯，外源性的脂质成分（如VLDL、 TG等）增多时，可导致HSC细胞表型的转化及细胞的增殖。体外细胞培养观察发现，在一定浓度下，TG、VLDL可促进HSC增殖，一些动物实验也同样从不同侧面证实，饮食中脂质含量高者更易形成脂肪肝和肝纤维化，两者常相继或同时发生于同一部位7。因此，TG、VLDL与HSC激活，脂

12、肪肝肝纤维化形成可能有密切的关系。此外，在实验中观察到很高浓度的TG(400mg/L)对HSC增殖有抑制作用，目前对此尚无满意的解释，推测可能与TG对HSC的毒性作用或者其它的原因，此现象有待再观察。本课题受国家自然科学基金资助(NO.39670339)作者单位：200001上海第三医科大学附属仁济医院上海市消化疾病研究所参 考 文 献1 Knittel T, Fellmer P, Ramadori G. Gene expression and regulation of plasminogen activator inhibition type 1 in hepatic stellate c

13、ells of rat liver. Gasteroenterology, 1996, 111: 745-754.2 张志强，田志刚，崔正言，等. MTT法检测NK和LAK活性的方法学探讨. 中国实验临床免疫学杂志，1994, 6: 12-16.3 Friedman SL. Molecular mechanisms of hepatic fibrosis and principles of therapy. J Gastroenterol, 1997, 32: 424-430.4 Ramadori G, Rieder H, Theiss F, et al. Fat-storing(Ito) c

14、ells of rat liver synthesis and secret apolipoproteins: comparision with hepatocytes. Gastroenterology, 1989, 97: 163-172.5 Reeves HL, Burt AD, Wood S, et al. Hepatic stellate cell activation occurs in the absence of hepatitis in alcoholic liver disease and correlations with the severity of steatosi

15、s. J Hepatol, 1996, 25: 677-683.6 Vicente CP, Guaragna RM, Borojevic R. Lipid metabolism during in vitro induction of the lipocyte phenotype in hepatic stellate cells. Mol Cell Biochem, 1997, 168: 31-39.7 Fernandez MI, Torres MI, Gil A, et al. Steatosis and collagen content in experimental liver cirrhosis are affected by dietary monounsaturared and poly