酶化醇解在燃料制造和油处理中的应用

1、酶化醇解在燃料制造和油处理中的应用摘要生物燃料（脂肪酸甲酯FAMEs）能够把废弃的含有一个脂酶的食用油采用甲基化生产制得，迄今为止被报道的是在反应系统中甲基化程度过低，而且无酶活性脂酶催化剂不能够被重复使用。我们需要澄清的问题是，不溶于甲醇的原因是脂酶的钝性不能被活化。基于这一结果，我们使用不活动的假丝酵母属脂酶逐步发展成为甲基化体系。全部甲基化是对来自于废弃油的生物燃料生产中最有效的部分，此过程可分为两步：第一步反应，处理1/3摩尔质量甲醇的化学数量，第二步反应是，通过增加2/3摩尔质量甲醇来反应。如果无活性的输送物被一个推动反应的搅动破坏，第三步反应将会发生作用：第一步的基体是废弃油和1/

2、3摩尔等量的甲醇，第二步是第一步的流出液和1/3摩尔等量的甲醇，反应第三步是第二步的流出液和1/3摩尔等量的甲醇，反应在两个反应体系中废弃油转化为生物燃料的转化率大于90%，而且脂酶催化剂在一百天之内活性不会消失，这种步骤化的醇解可以被成功应用于金枪鱼油的醇解。1 介绍环境污染意识的增强引发了零放射物的构思和废弃食用油的全部回收利用的想法，作为一个世界范围的社会问题引起相当的注意。在日本，每年排出400000t废气食用油，估计有一半用作动物饲料润湿油和喷漆，剩下的则被排入环境中。因此，从废弃使用油中制取生物燃料（脂肪酸甲酯FAMEs）被认为是减少和重新回收废弃油的重要一步。在这一方面，日本的几

3、个当地政府开始从家庭中收集使用过的废弃油并且将其转化为供应公共交通的生物能源。目前，工业生产生物燃料通过碱性催化剂甲基化废弃油来实现。产物中包括副产物、甘油、碱性催化剂、处理过后的废弃油等。由此可见，产生的碱水对环境产生的多方面影响，而在脂酶催化反应中，废弃油的酶化醇解不产生废弃物，所以用脂酶来制造生物燃料成为一种必然需求。2 迄今为止有关酶化醇解的报道 脂酶不仅被用来水解，而且被用在非水介质酯化作用中，脂酶的甘油三酯的甲基化被认为是从废弃食用油中提取生物燃料的一个最有效的方法。在我们开始研究酶化生物燃料的生产之前，酶化醇解的方法已经被报道。对于含20水分的长链脂肪醇，使用无活性的Rhizop

4、us delemar和Rhizomucor miehei的脂肪催化醇解。因为脂酶对多不饱和脂肪酸的作用弱，金枪鱼油和月桂醇反应中提出的醇化脂肪酸乙酯，除了多不饱和脂肪酸乙酯转化，还使得乙酯部分含有丰富的（PAFAEE）。鱼油的乙醇分解也使其富含多不饱和脂肪酸。当沙丁鱼和金枪鱼油使用了自由的假单细胞细菌脂肪酶的乙醇，经过一定化学计量的醇化的之后，脂肪酸（除了多不饱和脂肪酸以外）转化成乙脂。因此，在甘油脂部分富含二十二碳六烯酸(DHA)和eicosapentaenoic acid（EPA）。除了上述的醇解外，非选择性的甘油三酯甲基化也被报道。非活性的假丝酵母属酯酶和1.7摩尔等量乙醇被用来醇化多不

5、饱和脂肪酸油。因为这种酯酶和饱和脂肪酸对多不饱和脂肪酸的作用一样强，油被转化到对应的脂肪酸乙脂上中加入1.3摩尔等量的乙醇醇解，将使90的鱼油转化为醇化脂肪酸乙脂。尼尔森et al.首先将甲基甘油三酯的酶化醇解作为生产生物燃料的最终产物。在正己烷试剂中，当油和脂肪的醇化与甲醇、乙醇用固定的R.miehei 脂酶，则95的甲基甘油三酯将转化成为对应的甲（乙）酯。在缺乏有机溶剂的条件下，即使在相似条件中，牛脂甲醇分解的产量只有65。同时，如将长链醇在有机自由溶剂系统中作为基体则可增加牛脂的醇化，加入异丙醇反应中可达到90的转化率，而加入异丁醇和2丁醇则可达到95%的转化率。除此之外，据报道，加入甲

6、醇、乙脂固定的C.antarctica 脂酶适合作为醇化甲基甘油三酯的催化剂。先前的报道可以被总结如下：（1）加入长链脂肪醇的脂酶醇解的甲基甘油三脂的效率要高于加入甲醇、乙醇的效率。（2）在有机溶剂中使用甲醇、乙醇的醇解甲基甘油三酯的效率要高于不使用有机溶剂的。（3）虽然固定的脂酶被用来作为催化剂，但是酶制剂却不能重复使用，一个有机溶剂系统并不适合从废弃油中生产生物燃料，因为存在着爆炸危险和溶液更换的难度。因此，我们的目标就是发展一个无溶剂系统，可以保证甲基甘油三酯的转化率大于90。并且催化酶可以长时间使用。3 生物燃料的酶制法3.1 不能溶解于甲醇的脂酶的失活大体上，当基体彼此互溶，脂酶具有

7、效催化能力。我们第一个实验是调查菜油中脂肪醇的溶解性（一个大豆和油菜籽油的混合油）。含碳个数大于3的脂肪醇，在一个化学质量单位的脂肪醇能完全溶解于油，而在甲醇和乙醇中的溶解性分别为1/2、1/3。不可忽略的溶解性，至今的报道中单位化学质量醇化甲基甘油三酯大于单位化学质量的甲醇或乙醇。我们现在意识到蛋白质基本上不能在短链醇中存在，例如甲醇和乙醇，因此我们小于1/3摩尔等量的甲醇完全消耗在甲醇分解的菜油中,但是通过添加大于1/2摩尔等量的甲醇,则甲醇分解明显减少（如图1）。除此以外，所减少的活性不能存储在1/3摩尔等量的甲醇中，在与不溶于油的甲醇接触中将导致固定脂酶发生不可逆性失活。 图 1 图

8、23.2 菜籽油的甲醇分解的步骤由甲醇转化的相应的脂肪酸甲脂，固定C.antarctica脂酶的情况下，一个单位化学质量的甲醇能完成反应生成生物燃料由甘油三酸酯转化。然而，通过加入大于1/3摩尔等量质量的甲醇会使其活性丧失，并且甲基化停止。因此，我们试图将甲基化的菜油分三步加入1/3摩尔等量的甲醇。第一步，甲基化是在30混合油、1/3摩尔等质量的甲醇和4的固定脂酶的混合反应，7个小时后油的转化率达到33.1，紧接下来的第二个步骤1/3摩尔等量甲醇可使转化率在10小时后达到66.4，第三个步骤是1/3摩尔等量的甲醇被加入后，需要24小时，并且反应继续（总共48小时），转化率可以达到97.3（如图

9、2）。经过这三步的甲基化被有效并且近似将油完全转化。在甘油三酸酯中甲醇的溶解度很低，但是甲醇在脂肪酸甲酯中的溶解度很高。第一步反应可以加入甘油脂，33的脂肪酸甲酯和2/3摩尔质量的甲醇，防止全部脂肪酸被混合反应全部溶解，发现在混合甘油酯、脂肪酸甲酯和一定质量甲酯混合液中，固定脂酶的活性不失活。这个发现直接使得甘油三酸酯的两步甲基化取得成功。图2显示了一个典型的时间过程，第一步甲基化在混合油中开始是在30，1/3摩尔等量的甲醇和4wt固定脂酶，在这种情况下，转化率可以7小时达到33.2，然后在第10小时时加入剩下2/3摩尔质量的甲醇油转化为相应脂肪酸甲酯转化率可以达到96.8（总共34小时）。通

10、过调查，对稳定的有活性脂酶进行准备，二步和三步甲基化被重复进行，三步甲基化的步骤如下：第一步反应是发生在30的菜油，1/3摩尔质量的甲醇和4wt的固定脂酶组成的混合液中。第二个和第三个1/3摩尔质量甲醇别在第10小时和第24小时时添加，并且第三步反应需要继续进行24小时（总共48小时）。同时，两步甲基化反应和三步甲基化反应是在许多相同条件下进行的。在12小时时添加2/3摩尔质量的甲醇，这个反应还要继续24个小时（总共36小时）。这两个反应后的脂酶再转移到第一步反应中的油或甲醇混和液中循环利用，超过95的转变在三步骤甲基化反应中需经历52个周期（104天）或者在脂酶能够使用100多天并且不明显失

11、活。除此以外，在相同的可耐性条件下两部甲基化生产率增加了25。3.3 甲醇分解作用下蔬菜油的流动性 当生物燃料在工业生产中通过两步反应得到，一个反应者被用作推动者。然而，在一个较长时间内，使酶载体分解的物资力量被允许在固定的酶中使用。因此，我们试图使用一个两步的连续流动性反应作用于固定的C.antarctica脂酶。这种脂酶和植物油、1/3摩尔质量的甲醇混合不会被钝化，但是与第一步的流出液和2/3摩尔质量的甲醇混合会产生明显的钝化。如先前所做，在第二步反应中，添加的2/3摩尔质量甲醇不能使脂酶失活。这种差异或许可以通过甲醇分解作用和甘油的副产物的影响来解释。因为它的高黏质相当于许多甘油停留在反

12、应的底部。甘油扰乱了脂酶分子，并且在反应效率反方面逐渐减少，不反应的甲醇却逐渐增多。甲醇通过反应转移到了甘油层，并且甲醇在甘油层中的高聚集还引起脂酶的失活。同时，在两步反应中，一定量的甲醇被混合后，被固定的载体覆盖在甘油上。因此，两步反应的脂酶不能被甲醇钝化。脂酶不能被钝化，我们试图通过三步骤的菜籽油甲酯分解作用来实现，这个反应在30的（15mm×80mm）的反应器中加入3g的固定酶反应，菜籽油和1/3摩尔等量的甲醇混合物以持续的流速（60mol/h）进入第一反应器内（33转变）流出液被允许除去甘油，第二个1/3摩尔质量的甲醇被添加到甘油流出液，并且混合物被以固定的流速（6.0mol

13、/h，转化60）混合到第二反应器。最后一步在甘油流出液和1/3摩尔等量的甲醇中反应流速为(转化，93)。这三步反应持续100天，但是脂酶活性几乎没有减弱。最后的产物脂肪酸甘油甲酯的流速略低于前面一系列的反应，但是FFA的含量仅为0.2，这剩下的主要部分是乙酸甘油。这些结果显示固定的并不仅仅在第一步中有较高的效率而且在第三步中有较高的效率。 3.4 从废弃的食用油中生产生物燃料 我们的目标是通过酶化使废弃食用油转化为生物燃料，因为有步骤地醇解能有效的使菜籽油转化为其相应的FAMEs，我们的下一个目标就是从废弃食用油中生产生物燃料。 在废弃油的甲醇分解作用中水的作用 新鲜的菜籽油和废弃的菜籽油之间

14、最主要的差异就在于其中水分和自由脂肪酸含量的不同。废弃食用油中含有1980PPm水、2.5%的自由脂肪酸和4.6%的乙酸甘油。我们明白大于500PPm水分将减少甘油三酯的甲基化，但是并不影响反应的平衡。因此，我们首先研究水在废弃油甲基化中的影响。当植物油在1/3mol甲醇中甲基化时在1小时和7小时中的转化率分别是90%和33.2%（如图2）。即使甲醇分解作用被脂肪转移到一个新鲜的基体之内重复时，转化率也不会发生改变。 废弃油的醇解作用同样被重复（如图3），在第一周期中，1小时后的转化比植物油甲醇分解作用慢，这种转化重复出现频率增加；在第二、第三、第五周期中转化在一个小时后开始；转化率分别为3.

15、0%、8.3%、10.7%。这些结果表明在反应周期中如果有少量水存在的条件下醇解作用也会被停止，这些水则会被除去。 图 3 图 4 废弃油醇解作用速率加快的原因可以被解释为以下几个方面：水通过醇解作用首先进入甘油层，因为只有水被排出醇解作用体系之后，反应的速度才能渐渐增加。事实上，在FAMEs层的水含量减少到500PPm，并且5个周期后甘油层变为4.7%。当33%废弃油被转化为FAMES，则甘油的含量在这个反应中可被计算出为3.9%。在油层中水的含量减少到1480PPm（等于1980-500），如果水分转移到甘油层，这个含量将会变为4.2%，这个和前面一个一致。这些结果表明在固定的脂酶中被吸附

16、的水对于重复反应能达到持续的作用，并且含水量不会因醇解作用而发生改变。 废油甲醇分解作用的三步骤 固定的C.antarctica脂酶对于废弃油和菜籽油的三个步骤和5个周期起着重要的作用，就如图4所示的那样在这两种油间发生的第一步和第二步醇解作用过程中没有存在明显的差异，并且在第一步和第二步反应之后，FAME的含量分别达到34%和36%。然而废弃油在第三步醇解作用之后其转化率可以达到90.4%，而菜籽油的转化率可以达到95.9%。这种差异可以被归结为废弃油中被氧化的脂肪酸化合物。一般来说，当菜籽油被用作煎炸时，一些脂肪酸通过氧化作用可以转化为过氧化物，乙醛、聚合物等。因为这些脂酶不能识别这些混合

17、氧化物，而且废弃油的转化率仅仅减少了一点。另外，自由脂肪酸在第三步反应后的含量（0.3%）低于在废弃油中的含量（2.5%），说明自由脂肪酸的醇解产物发生在油的醇解作用之后。 为了证明脂酶的稳定性，这三步醇解作用反应重复发生并转化为新的物质。第一步，10小时；第二步，14小时；第三步，24小时。在50个周期后（100天）后这种转变并没有明显减少，表明在废弃油中的污染并没有明显影响脂酶的稳定性。 图 5 废弃食用油是制造生物燃料的合适的材料，而且粗食用油也是合适的材料。因此我们试图从大豆粗油中提取生物燃料（细节就在以下的报告中）。但是使用固定的C.antarctica脂酶的甲醇分解作用不能使粗油制

18、成相应的FAMEs。在可食用油的精练过程中，抽出的下一个步骤是提纯。因此，我们通过对粗大豆油的甲醇分解作用的三个步骤来实现。与精练油的醇解作用相比较每个步骤的反应速度是其的一半，在三个步骤中其转化率可以达到多于90%，并且固定的脂酶可以使用多于20个周期（50天）。大豆树胶的主要组成部分是磷脂（PLs），并且每增加1%的大豆磷脂在精练大豆油中就可以限制醇解作用。此外，已经在被应用与大豆粗油醇解作用的固定的脂酶中提取的磷脂体积比为2：1。这些结果都表明了磷脂在固定的载体周围跳跃并且干扰有基体的脂酶的交互作用。因此这种油被用来做为剩余食用油的基体。4 使用自由脂酶的TAGs的甲醇分解作用 就先前所

19、叙述，Dr.Haraldsson et al。报道鱼油的醇解必须使用大量的Pseudomonas脂酶（大约占混合质量的10%）。我们假设必须要运用大量的脂酶。因此，如果失活的酶被去除掉，那么仅仅需要少量的就可以达到很高的效率。Prof.Fukuda，Kobe大学的实验发现在含有10%-30%的水反应混合物中使用自由的Rhizopus oryzae脂酶通过三步反应可以使80-90%的大豆油转化为相应的FAMEs。这些结果表明脂酶的失活是由于甲醇被水稀释的缘故。这个反应包含了大量的水，但是TLC分析表明了大量的自由脂肪酸在反应的早期阶段被发现但是在反应结束的时候含量却非常低。这表明大豆油连同它的醇

20、解作用中的醇解作用。5 醇解在油处理过程中的应用5.1鱼油的所含有的酶解分解的乙醇。UFAs有各种不同的生理学的功能，而且被由于各种不同的区域。日本环保署在1991年的时候就把甲脂作为动脉硬化和yperlipemia的治疗。二十二碳六烯酸的生理学方面的作用已受到环保署的重视，已证明在大脑和细胞膜的发育方面有重要的生理作用。除此之外，二十二碳六烯酸能加快婴儿大脑的发育。因为这些理由，十二碳六烯酸的甲酯现在被认为可以当作一种药品可以使用，目前迫切的需要掌握他的提取方法。 金枪鱼油醇解作用的步骤化我们首先研究乙醇使固定C.antarctica脂酶的失活。这种酶在2/3mol质量的乙醇存在时也可以使其

21、失活。为了避免这种失活，第一步醇解作用是在40的混合金枪鱼油，1/3mol质量的乙醇，使用4wt%的固定脂酶的条件下进行。这个反应完全消耗乙醇需要10个小时，有33%的金枪鱼油转化为相应的乙酯。在第一步反应中总的脂肪酸消耗完之前存在2/3mol质量的乙醇可以使脂酶避免失活。基于这些结果，两步和三步金枪鱼油的乙醇分解作用反应条件的不同可以被列举在以下内容。两步反应：第一步在10克金枪鱼油在40，1/3mol质量乙醇，4wt%固定的脂酶条件下保持12小时；第二步增加2/3mol质量的乙醇下进行36个小时（总共为48小时）。三步反应：第一步反应两步反应的第一步一样；第二步反应和第三步反应分别在12小

22、时和24小时后添加1/3mol质量的乙醇，并且第三步反应持续24小时（总共48小时）。通过调查酶的稳定性，在新的基体中第二步和第三步反应可以重复进行。这些结果如图6所示。两步反应的醇解作用的转变到第37个周期才开始减少，并且迅速的减少。然而，三步反应的转化可以维持到第54个周期（108天）。两步醇解作用中的脂酶的失活 在表6中描述的三步反应，这个固定脂肪酶的活性在使用了54个周期之后其最初活性降低了32%。这也表现出一些乙醇仍然存在于第一步反应中。从这个结果可以看出，在两步反应酶的活性的减弱可以被解释为以下几个方面：（i）通过长时间的使用脂酶的活性在逐渐减弱；（ii）在第一步反应结束的时候仍然有少量乙醇存在；（iii）当2/3mol乙醇被添加到第二步反应的开始时，这些乙醇的数量仍然超过了保持脂酶稳定性的需要；（iv）因此，高含量的乙醇使得反应转化率的减低。换一种说法，由于1/3mol乙醇被添加到第三步反应，但是在总反应中乙醇的添加量不能够超过2/3mol。因此，脂酶不是被乙醇钝化的。这些结果表明在第一个1/3mol质量的甲醇消耗完后再添加2/3mol质量的乙醇可以是脂酶保持长时间的活性。在30用废弃食用油生产生物