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文档简介
1、南京农业大学生物化学第五节第五节 酶的提取纯化与活力测定酶的提取纯化与活力测定南京农业大学生物化学一一. .酶的分离与提取酶的分离与提取 酶提取基本的方法酶提取基本的方法细胞产生的酶有二类:细胞产生的酶有二类:1. 1. 由细胞内产生后分泌到胞外发挥作用的酶,称为由细胞内产生后分泌到胞外发挥作用的酶,称为细胞细胞外酶外酶。这类酶大部分属于水解酶。此类酶通常含量高,容。这类酶大部分属于水解酶。此类酶通常含量高,容易得到。易得到。2. 2. 在细胞内合成后并不分泌到细胞外,而在细胞内起催在细胞内合成后并不分泌到细胞外,而在细胞内起催化作用,称为化作用,称为细胞内酶,细胞内酶,该类酶在细胞内往往与细
2、胞器结该类酶在细胞内往往与细胞器结合,不仅有一定的区域性,而且催化的反应具有一定顺序合,不仅有一定的区域性,而且催化的反应具有一定顺序性。性。A. A. 了解所分离酶在细胞中分布了解所分离酶在细胞中分布 南京农业大学生物化学B. B. 材料的获取材料的获取 在提取某一酶时,首先应当根据需要,选择含在提取某一酶时,首先应当根据需要,选择含此酶最丰富的材料。由于从动物内脏或植物果实中此酶最丰富的材料。由于从动物内脏或植物果实中提取酶制剂受到原料限制,成本又很大,因此,目提取酶制剂受到原料限制,成本又很大,因此,目前工业上大多采用培养微生物的方法来获得大量的前工业上大多采用培养微生物的方法来获得大量
3、的酶制剂。酶制剂。一一. .酶的分离与提取酶的分离与提取 酶提取基本的方法酶提取基本的方法南京农业大学生物化学C. 酶分离纯化的主要步骤酶分离纯化的主要步骤1.主要步骤为:抽提、纯化、结晶主要步骤为:抽提、纯化、结晶 抽提:抽提:破碎细胞,动植物组织一般可用组织捣碎器;破碎细胞,动植物组织一般可用组织捣碎器;或者加石英砂研磨,将材料做成丙酮粉或进行冰冻或者加石英砂研磨,将材料做成丙酮粉或进行冰冻融解融解 ;对细菌,常采用加砂或加氧化铝研磨和超声;对细菌,常采用加砂或加氧化铝研磨和超声波振荡方法破碎。波振荡方法破碎。 大多数酶一般都用缓冲液进行抽提,缓冲液的大多数酶一般都用缓冲液进行抽提,缓冲液
4、的类型决定于酶的种类和理化特性,抽提液类型决定于酶的种类和理化特性,抽提液pHpH最好远最好远离等电点离等电点 。 一一. .酶的分离与提取酶的分离与提取 酶提取基本的方法酶提取基本的方法南京农业大学生物化学C. 酶分离纯化的主要步骤酶分离纯化的主要步骤1.主要步骤:抽提、纯化、结晶主要步骤:抽提、纯化、结晶 浓缩:浓缩:抽提液或发酵液中酶浓度往往很低,必须浓抽提液或发酵液中酶浓度往往很低,必须浓缩富集。常用的浓缩方法有:加中性盐或冷乙醇沉缩富集。常用的浓缩方法有:加中性盐或冷乙醇沉淀后再溶解,胶过滤浓缩以及超过滤浓缩法等。淀后再溶解,胶过滤浓缩以及超过滤浓缩法等。纯化:纯化:纯化过程就是去除
5、杂质的过程。原则:一方纯化过程就是去除杂质的过程。原则:一方面是要提高酶的纯度,另一方面却也使酶的总量不面是要提高酶的纯度,另一方面却也使酶的总量不可避免有所损失。可避免有所损失。 一一. .酶的分离与提取酶的分离与提取 酶提取基本的方法酶提取基本的方法南京农业大学生物化学C. 酶分离纯化的主要步骤酶分离纯化的主要步骤1. 主要步骤为:抽提、纯化、结晶主要步骤为:抽提、纯化、结晶 结晶:结晶:浓缩液经过各种方法的纯化,可得到较纯的浓缩液经过各种方法的纯化,可得到较纯的结晶产品结晶产品。 一一. .酶的分离与提取酶的分离与提取 酶提取基本的方法酶提取基本的方法南京农业大学生物化学C. 酶分离纯化
6、的主要步骤酶分离纯化的主要步骤2. 选择分离纯化方法选择分离纯化方法a.盐析法(如硫酸胺)盐析法(如硫酸胺) b.有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法 c.层析纯化法(葡聚糖凝胶、阴离子交换层析)层析纯化法(葡聚糖凝胶、阴离子交换层析) d.等电点法等电点法 e.吸附分离法吸附分离法 一一. .酶的分离与提取酶的分离与提取 酶提取基本的方法酶提取基本的方法南京农业大学生物化学1. 1. 酶活力概念酶活力概念 酶活力酶活力 是酶促反应的能力。酶活力大小是酶促反应的能力。酶活力大小就是指在一定条件所催化的某一化学反应速就是指在一定条件所催化的某一化学反应速度的快慢,即酶催化的反应速度越快,酶活度的快慢,即
7、酶催化的反应速度越快,酶活力越高,反之则表示该酶活力低。力越高,反之则表示该酶活力低。 二二. .酶活力及其测定酶活力及其测定 南京农业大学生物化学但是,酶的定量并非对其蛋白质进行但是,酶的定量并非对其蛋白质进行定量,而是对它的定量,而是对它的催化能力催化能力进行定量。进行定量。二二. .酶活力及其测定酶活力及其测定 1. 1. 酶活力概念酶活力概念 南京农业大学生物化学二二. .酶活力及其测定酶活力及其测定 1. 1. 酶活力概念酶活力概念 南京农业大学生物化学二二. .酶活力及其测定酶活力及其测定 1. 1. 酶活力概念酶活力概念 南京农业大学生物化学 A. 国际单位 (IU) 2. 2.
8、 酶活力与单位酶活力与单位 二二. .酶活力及其测定酶活力及其测定 南京农业大学生物化学 B. Katal2. 2. 酶活力与单位酶活力与单位 2. 2. 酶活力与单位酶活力与单位 二二. .酶活力及其测定酶活力及其测定 南京农业大学生物化学 C. 自定义的活力单位这种单位简单方便,省去了许多计算;但只能这种单位简单方便,省去了许多计算;但只能进行酶活力的相对比较。进行酶活力的相对比较。2. 2. 酶活力与单位酶活力与单位 2. 2. 酶活力与单位酶活力与单位 二二. .酶活力及其测定酶活力及其测定 南京农业大学生物化学指指每毫克每毫克酶蛋白所含的酶蛋白所含的酶活力单位数酶活力单位数3. 3. 酶的比活力酶的比活力 二二. .酶活力及其测定酶活力及其测定 南京农业大学生物化学4. 4. 酶的纯度酶的纯度 二二. .酶活力及其测定酶活力及其测定 南京农业大学生物化学4. 4. 酶的纯度酶的纯度 二二
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