带状疱疹后神经痛动物模型及其相关病理机制研究进展

1、带状疱疹后神经痛动物模型及其相关病理机制研究进展项红兵* 招伟贤* 田玉科# 张咸伟# * 广东省中医院麻醉科，广州 510120 # 华中科技大学同济医学院附属同济医院麻醉科，武汉 430030带状疱疹后神经痛(Postherpetic neuralgia，PHN)是发生带状疱疹后遗留的严重并发症，它通常定义为带状疱疹消失后在原发疱疹的皮区（部位）出现的持续的自发痛、轻触痛和感觉异常1-3。较少有人认为PHN的定义与疱疹初始出现的时间相关。以前PHN被诊断为带状疱疹发作后疼痛和伴随的异常感觉持续1个月；另外有作者疱疹治愈后疼痛持续3个月和6个月才能诊断为PHN。Opstelten等4报道大约

2、有9-34%的带状疱疹病人发展为PHN，发生PHN的主要危险因素是年龄，如有报道在3049岁年龄组PHN的发生率为34%，7079岁年龄组PHN的发生率则上升为29%，而80岁以上年龄组PHN的发生率超过34%5。在人群中PHN总的发生率难以确定，Bennett6认为在任一时间点内，美国大约有50万的PHN病人，而Bowsher7则认为在任一时间点内，英国有30万的PHN病人则是一保守估计。PHN能导致病人户外活动减少、睡眠障碍、回避社交和抑郁表现，这种疼痛状态若长期存在会常常严重影响生活质量。目前对于PHN的有效治疗还很欠缺，有相当一部分PHN不能得到理想控制。发展新疗法的最大障碍在于PHN

3、病理机制不甚明了。长期以来，并没有适当的带状疱疹和PHN动物模型，用于带状疱疹和PHN的神经生物学机制研究以及治疗PHN新药的评价。近年来有关带状疱疹和PHN动物模型的研究进展较快，为人们深化认识PHN病理生理机制和开发治疗PHN新药新方法提供了努力方向。本文就PHN动物模型及相关的病理机制等方面所取得的进展进行了综述。一、带状疱疹后神经痛动物模型的建立目前已经认识到, 带状疱疹后的慢性痛感异常具有水痘-带状疱疹病毒（Varicella zoster virus,VZV）特异性5，8，因此带状疱疹后神经痛动物模型必然涉及到研究VZV对离体和在体神经元的影响以及探索建立与人类带状疱疹症状相似的动

4、物模型。2001年Kress等9体外制作人类VZV感染大鼠背根神经节（DRG）之感觉神经元模型，他们首先进行原代培养成熟雌性Wistar大鼠腰段DRG神经元（主要的伤害感受性神经元），然后使VZV感染DRG神经元。结果表明，35%50%DRG神经元有即刻早期病毒抗原IE62 、IE63和晚期糖蛋白的重度表达；在VZV感染过的DRG神经元中，检测单个细胞内钙离子浓度变化发现：对GABA或辣椒素的敏感性是相同的，但钙离子浓度的基线增加了。VZV感染后DRG神经元对肾上腺素能刺激敏感增加，去甲肾上腺素（疼痛相关的神经递质）敏感性神经元放电频率增加。实验组感染野生型VZV的神经元内钙离子比对照组感染减

5、毒疫苗株OKA的神经元对去甲肾上腺素的反应明显升高。感染野生型VZV株后，感觉神经元对去甲肾上腺素敏感，是通过1/1肾上腺素受体，此模型揭示了VZV病毒突变株引起肾上腺素受体上调的遗传学基础提供有价值的研究工具，这对于研究急性带状疱疹神经痛、与VZV再激活相关的严重疼痛的病理生理发生机制有价值。该研究报告了一种新的细胞模型，即神经元急性感染VZV，与对照组相比，细胞感染2天后钙离子的基线水平明显升高，其中50%辣椒素敏感性神经元表达增加。1999年Fleetwood-Walker等8成功复制出水痘-带状疱疹病毒慢性感染模型，他们将受VZV感染的细胞液50µl（内含4×106

6、）皮下注射至雄性Wistar大鼠的光滑无毛足垫，连续检测大鼠疼痛行为学改变，发现：一直到注射后33天，患侧后肢仍可观测到行为学上的痛感异常和痛觉过敏，与对侧相比患侧后肢痛阈下降。腰36背根神经节（DRG）中IE63蛋白表达与疼痛敏感性增加呈相关性，此模型对研究疱疹后神经痛发生机制有价值。另外，与对照未感染组相比，感染组大鼠患侧腰部DRG中证实有IE63存在，在DRG节段未发现炎症性浸润和神经细胞坏死的证据。此模型可能表明，DRG中VZV的存在与对感受刺激敏感性增加呈相关性。2004年Dalziel等5报道了大鼠左足蹼感染VZV后发生慢性机械性痛感异常的动物模型，他们使大鼠左足蹼48×

7、106VZV感染非洲绿猴肾母纤维细胞（CV-1细胞），感染后超过60d还存在痛敏异常，感染后100d消失。此模型具有可重复性，感染后34d首次出现痛感异常，症状持续存在至少30d。可重复的天性和痛感异常的时程允许用这种模型去评价多种化合物的疗效，以及研究VZV引起痛感异常的病理机制。使用单纯疱疹病毒型（HSV-1）比较性研究表明，慢性痛感异常的出现是VZV特异性，不是病毒复制引起组织损害或伴随炎症的一种结果。此两种模型虽然均能检测到大鼠疼痛行为学改变，但不足之处是在模型中没有发生水痘和急性疼痛。因此，由于存在水痘-带状疱疹病毒的种特异性，到目前为止还没有与人类带状疱疹相似的动物模型。Takas

8、aki等5报道了接种VZV复制疱疹后神经痛动物模型，VZV感染后34d首次观察到痛感异常，持续至感染后60d不消失。在感染后75d，痛感异常开始减轻直至100d左右恢复正常。这个反应的慢性发生/消退过程与临床上观察到的PHN病人出现痛感异常模式是相似的，这表明这对于研究VZV诱发的痛感异常发生机制是一个成功模型。2000年Takasaki等10报道，将单纯疱疹病毒型（HSV-1）接种到小鼠后爪上，历经4d的潜伏期后在被接种的皮区出现带状疱疹样皮损。该皮损区对无伤害的触觉刺激和有伤害的机械刺激显示疼痛样反应。即使不给小鼠任何刺激，它也会舔、退缩被接种的后爪。在后来研究中Takasaki发现，交感

9、神经和-肾上腺素没有参与HSV-1感染引起的疼痛相关反应，小鼠也没有出现热痛觉过敏11。2002年Takasaki等12报道，HSV-1接种5天后患侧后爪疼痛相关反应更加明显，此时HSV-1在背根神经节增生，因此小鼠接种HSV-1的疼痛相关反应机制与人类带状疱疹痛发生机制是相似的。有趣的是大约有一半的急性疱疹痛小鼠在皮损完全愈合后有长时期的疼痛相关反应12。因此，此小鼠模型能够检测运用止痛剂抑制急性疱疹痛是否影响疱疹后神经痛的发生率。基于多年的研究，Takasaki等5在2004年报道了与人类带状疱疹症状相似的动物模型，并将其用于评价药物治疗PHN的疗效。他们给小鼠接种HSV-1，5d后引起带

10、状疱疹样皮疹和疼痛相关反应（触痛异常和机械性痛觉过敏）,15d后皮肤病损完全愈合，大约有一半的急性疱疹痛小鼠在病损愈合后相当长的一段时间内存在疼痛相关反应。使用这种小鼠模型，他们检测了重复使用加巴喷丁和阿米替林在急性疱疹痛和疱疹后疼痛发生率中的效应。从接种后第5至11d每天3次注射加巴喷丁和阿米替林，在接种30d评判疱疹后疼痛反应。加巴喷丁（10-100mg/kg）对急性疱疹相关反应产生剂量依赖性抑制，它明显减少疱疹后疼痛的发生率，100mg/kg加巴喷丁则完全抑制。10mg/kg阿米替林在开始的2-3天内不影响急性疼痛相关反应，之后逐渐抑制，这种剂量虽然能够但不显著的减少疱疹后疼痛相关反应的

11、发生率，而1mg/kg和3mg/kg阿米替林对急性疱疹痛和疱疹后疼痛相关反应无影响。此结果支持，急性疱疹痛的严重程度是疱疹后神经痛的一个危险因素，将加巴喷丁用于治疗人类急性疱疹痛和预防疱疹后神经痛的发生可能是值得的。二、两种疱疹病毒及其疱疹后神经痛动物模型比较使用水痘-带状疱疹病毒（VZV）特异性复制出的疱疹后神经痛动物模型能检测到大鼠疼痛行为学改变，但在模型中没有发生水痘和急性疼痛；而使用单纯疱疹病毒型（HSV-1）复制出的疱疹后神经痛动物模型与人类带状疱疹症状相似，即既有带状疱疹样皮疹，又有疼痛异常相关反应。因此有必要对这两种疱疹病毒及疱疹后神经痛动物模型比较。水痘带状疱疹病毒（VZV）和

12、单纯疱疹病毒（HSV）均属于型疱疹病毒，其特征均是生长周期短和细胞间传递快，从而导致细胞/组织的广泛感染13。初次感染后，VZV和HSV均潜伏在感觉神经节，并持续宿主的一生14。各种各样刺激能诱使处于潜伏期的病毒再激活，之后沿轴突逆行，在初发感染部位重新产生新的环状复发性感染灶。VZV是人类两大疾病的病原：与初次感染相伴的水痘，以及在受累皮区感觉神经节处于潜伏感染的病毒再活化而发生的带状疱疹或水疱；相反，HSV潜伏感染的再活化最常导致冷溃疡（cold sores）或生殖器损害。两类病毒的原发和复发性感染常与疼痛和其它异样感觉相伴随。临床上HSV感染事件常有持续6-12的前驱期，通常情况下局部皮

13、损出现4d后其相伴的疼痛症状常消失，只有极少数病例遗留下较长时期的后遗症。带状疱疹（herpes zoster , HZ）是由潜伏在感觉神经节的VZV再活化所引起，沿感觉神经向外周移行，这导致区域性、疼痛性水疱疹的发生，并累及到邻近皮区15。与HSV感染事件相反，HZ在前驱期和临床期均有更长一段时间的严重疼痛，并持续3周时间。Takasaki等5使用HSV-1复制的疱疹后神经痛动物模型，通过对疱疹发作、时期和程度等行为反应的观察，证实了此大鼠模型能较好地模拟临床上观察到的带状疱疹病人反应。HSV-1感染后，痛感异常反应在感染后12天可测出，但感染后7天即消失。这与Takasaki等同时观察到的

14、接种VZV复制疱疹后神经痛动物模型的痛感异常持续时间相反，后者与HSV-1组有明显差异，直至至少60天。VZV接种后观察到的痛感异常幅度高出基线3040%，而HSV-1接种后观察到的痛感异常幅度高出基线80%。在病毒接种后动物所产生的相关症状也有明显差异，接种VZV后出现一些皮肤损害和后肢麻痹，这表明此感染已经波及到中枢神经系统，这与Stevens报道的动物80%出现肢体麻痹相一致5。相反，在此研究或以前研究中VZV处理的动物未观察到皮肤损害和麻痹16，17。在多种HSV-1感染的疱疹后神经痛动物模型中已经证实HSV-1病毒具有可重复性18-20。接种热灭活的HSV-1病毒的动物未发生痛感异常

15、，使用抗病毒药物valacicovir无效，表明感染后动物的行为变化是由病毒活化复制的结果，而不是注射过程或对外来蛋白的炎性反应5。相似的是，Takasaki报道18过小鼠接种HSV-1感染后观察到短暂的痛感异常，使用抗病毒药无效，推测HSV-1产生的痛感异常是由于在神经节病毒复制造成的。由此推测，HSV-1感染后的痛感异常与临床上观察到的皮肤病损（冷溃疡）或疱疹存在的急性痛是一致的。与HSV研究相比较，VZV感染的动物模型中VZV复制发生少21。病毒再激活仅仅发现在体外重复应激后且效应低21。Takasaki等5使用VZV复制的疱疹后神经痛动物模型中未能证实VZV病毒的复制，他们观察到的痛感

16、异常似乎与带状疱疹急性期所见到的正在进行的病毒复制无关（直到疱疹出现后30天），此结果受到以前观察到的用valacicovir治疗VZV感染的大鼠不能阻止其痛感异常的发生所支持，这表明：这些变化不是病毒裂解性复制和继发DRG坏死的结果。可见，抗病毒治疗在治疗带状疱疹和影响PHN进展方面是有效的，此治疗窗是疱疹发生后72h内，如此短的治疗期是有效的，这表明此治疗有效性是由于病毒负载量减少的结果5，22。我们推测：一旦潜伏感染被重新建立起来，此模型模拟PHN病理发生的后期。三、带状疱疹后神经痛的病理机制研究进展 带状疱疹后神经痛(PHN)的病理变化是复杂的，其机制知之不多。临床上疱疹的病理学特征是

17、神经节炎症和出血坏死，以及伴随有运动和感觉根的变性，这表明免疫反应是疱疹痛的一个因素23。当前PHN牵涉到免疫反应已经被证实，在一些PHN病人死后尸检中已经观察到炎症的存在。Gilden认为PHN可能涉及到VZV不同程度的持续存在，通常在潜伏期伴随有持续的炎症24。然而PHN对阿片类药和非甾体抗炎药（它们主要适用于急性和炎性疼痛状态）疗效不佳，表明炎性反应不足以引起PHN。目前认为包括PHN在内的神经病理性疼痛的特征是在中枢神经系统的损害区域神经元兴奋性过高，这过高的兴奋性是由于外周伤害性感受器、DRG、脊髓后角和脑等多个水平的分子变化（如钠通道的异常表达、-GABA抑制的变化）25。1. V

18、ZV潜伏感染的分子机制带状疱疹后神经痛区别于其他的神经病理性疼痛，其病理机制涉及到VZV潜伏感染的分子机制。目前VZV潜伏感染是如何与神经元发生作用进而引起分子变化还不十分清晰，但了解控制VZV潜伏期的病毒和分子因素、潜伏期病毒如何与感觉神经元发生相互作用以及可能如何引起“高兴奋状态”，是必要的。研究表明，VZV裂解性感染的基因转录伴随着复杂的级联反应，即刻早期（IE）基因是最先被转录，这些调节蛋白的激活涉及到病毒DNA复制、早期基因的转录。一旦启动DNA复制，迟发性基因就转录。在神经节的神经元中潜伏感染期间，观察到病毒基因表达的限制性模式。在VZV潜伏感染的人类神经节和大鼠潜伏模型中，已证实

19、存在5种VZV编码的mRNAs和蛋白，即开放阅读框（ORFs）4，21，29，62和6326，27。Lungu等27基于有限数量的病人死后观察所得，认为这5种VZV蛋白在潜伏感染中有明确的胞质定位，在再激活过程中有核定位和胞质定位。其中ORFs62编码大多数病毒转录激活子，即早基因IE62能调控所有活性的病毒基因如ORFs 21和29的转录5。IE62是一种病毒颗粒元件，可能在激活病毒基因使之处于开放状态有重要作用。IE62主要定位在感染细胞的核内，已经证实IE62能与ORF4发生特异作用，改变ORF4的定位，使ORF4从主要分布在胞质中进入主要在核内。IE62能与转录因子USF发生作用，在控

20、制涉及到伤害性感受的神经肽类转录中发挥主要角色28，29。ORF4，IE63和ORF29基因产物均能调制IE62的作用。ORF4对IE62功能有正性效应，IE63和ORF29对IE62功能有正、反效应。已经报告ORF29在纤维肉瘤细胞中能增加IE62依赖的病毒迟发基因的表达，而在神经细胞系则下调病毒迟发基因的表达30。这些病毒调节蛋白在潜伏感染的神经元交互作用，对胞内转录和神经元功能产生影响，正如Gilden研究认为的那样，在感觉神经节中VZV蛋白的过度表达可能对慢性炎性反应充当一个刺激物/靶标24。2. 镜像痛的胶质细胞机制很早人们就发现带状疱疹病人存在疼痛敏化即最痛区域（most pain

21、ful area）和镜像痛（mirror-image pain）区域，如图1所示。Gilden等31报道两例单侧外科手术后引起对侧相应皮区带状疱疹。此二病例反映出带状疱疹的形成不仅在时间上与手术有关，而且与手术的部位有关，是在手术对侧相应的皮区分布的。以往研究结果表明，单侧的带状疱疹可使双侧节段的初级感觉神经元损伤，另外已经证实神经损伤产生的触觉障碍通过脊髓后索向上投射，又通过脊柱上的相应位点输入，以上述结果为基础作者推测单侧的手术可以影响相应的神经节，这一过程可能有手术皮区以上的脊髓通路参与31。这一观点否定了周围机制（例如由一些循环因素），而支持中枢机制，特别是经过存在于脊髓和脑干的联络神

22、经元传递信号。用疼痛的神经元理论不能合理解释镜像痛等现象,促使人们将目光转向脊髓背角内大量的非神经元星形胶质细胞和小胶质细胞，以探讨其在痛信息传递过程中的调节作用。有关脊髓胶质细胞引起镜像痛效应的机制已引起极大的关注。虽然目前的资料支持胶质细胞在调制带状疱疹性神经节炎症所导致的痛超敏效应中的作用，但均未阐明脊髓神经炎症是如何导致胶质细胞激活的。Milligan等32认为有三种可能机制发挥作用。其一是胶质细胞能直接被脊髓后角感觉神经元所释放的递质所激活。实际上，星形胶质细胞和小胶质细胞能被致痛性神经递质如P物质、ATP、CGRP和谷氨酸所激活。脊髓中星形胶质细胞通过P物质结合NK-1受体方式被激

23、活；小胶质细胞也表达非经典的NK-1受体。IL-1和TNF协同释放P物质，增加人类脊髓胶质细胞释放IL-6和前列腺素（PG）。另外，P物质使星形胶质细胞释放IL-6和PG。实际上脊髓中AST，而不是各种脑区分离出的AST，针对P物质的反应释放PG，这表明：脊髓胶质细胞独特地对脊髓后角的神经递质发生反应。细胞外的ATP和ATP代谢物有刺激AST释放PG，刺激小胶质细胞释放TNF、IL-1、IL-6。CGRP和Glu也刺激IL-6释放。这些反应是发生在脊髓AST还是小胶质细胞还不十分清晰。然而大鼠脊髓胶质细胞至少对ATP和Glu发生反应，这是由于它们均表达ATP 、NMDA、AMPA和kainat

24、e受体。图1带状疱疹病人皮肤的最痛区域和镜像痛区域示意图第二种可能性是带状疱疹性神经节炎症间接激活脊髓胶质细胞。脊髓后角高度激活的神经元从其外表面释放fractalkine。fractalkine是被称为化学因子的免疫相关性蛋白家族成员之一，该致炎因子能引起免疫激活和胶质细胞激活。实际上，fractalkine受体表达在脊髓后角的小胶质细胞上，阻止这些受体能消除带状疱疹引起的单侧疼痛和镜像痛。另外，鞘内注射fractalkine 能引起机械性痛过敏，后者能被鞘内注射IL-1ra所阻止。因此带状疱疹性神经节炎症驱使的脊髓后角神经元至少通过部分释放作为神经元-胶质细胞的信号分子fractalkin

25、e，来激活胶质细胞，释放致炎因子。第三种可能性是来源于带状疱疹性神经炎症的信号激活脊髓-脑-脊髓环路（spinal cordbrainspinal cord loop），进而反过来激活胶质细胞。当然，来源于外周组织炎症的过强疼痛刺激也激活这样一个环路。值得注意的是这持续的过强烈的疼痛状态是由脊髓胶质细胞激活和致炎因子所调制。另外，来自于带状疱疹处神经病变的疼痛通过脊髓-脑-脊髓环路产生，这也涉及到脊髓胶质细胞激活和致炎因子。虽然如此环路真正存在于镜像痛当中，但目前的证据只是此通路最终导致脊髓胶质细胞激活，最有可能是通过顺向轴突释放P物质和兴奋性氨基酸。3. 脊髓背角A-神经纤维的芽生机制皮肤、

26、初级传入纤维输入至脊髓背角的组织通路示意图见图2。正常状态下，脊髓感觉神经元包括：广动力（wide dynamic range，WDR)神经元、低阈值神经元和高阈值神经元。WDR神经元和低阈值神经元对触压、轻刷等刺激产生反应较强。WDR神经元分为伤害特异性（nociceptive specific, NS）和非特异性两类（non-nociceptive, Non-N），前者分布在脊髓背角髓板、浅II、层，而后者分布在脊髓背角髓板深II、层33。脊髓背根神经节神经元包括：大神经元，内含有髓鞘的A-纤维（投射至深II、层），传递一般躯体的本体感觉及触压觉；中神经元内含无髓鞘的A-纤维（投射至、浅I

27、I、层）和小神经元内含无髓鞘的C纤维（投射至、浅II、层），后二者传递一般躯体的痛温感觉及一般内脏感觉。已经有研究表明，带状疱疹和疱疹后神经痛的发病机制中存在紧发条（wind-up）现象。紧发条现象是在应用恒定强度的重复刺激神经纤维过程中观察到的，它是伤害性神经元发生的频率依赖的不断加强的易化反应。在正常动物，脊髓神经元的紧发条仅由刺激初级传入性C纤维所引起，而单独刺激A-纤维没有出现紧发条34.。然而，在由外周损伤或炎症引起的一些痛敏状态，单独刺激A-纤维也出现紧发条35。由C纤维激活产生的紧发条称之为“紧发条样疼痛”。在痛觉过敏持续20h的动物中观测到明显的A-纤维的时间总和现象，但在炎症

28、后3h或6h时则未观测到。应用1Hz成串刺激能观测到A-紧发条，而Hz或0.1Hz成串刺激不能观测到，这表明A-紧发条与C纤维紧发条具有相同的频率依赖性。总之，A-纤维引起紧发条或时间总和，能在动物和人中观测到，仅在痛敏状态36。在痛敏处，有学者认为存在一种A-纤维接通C纤维机制，即A-纤维芽生至背角髓板浅II层（见图2），这种假设认为神经损伤或炎症至少20h后，A-纤维芽生至更多的脊髓背角髓板浅层，以接通伤害性神经元。为验证此假设，一些证据表明：(1)在紧发条中A-纤维作用仅仅是在神经损伤或炎症至少20h后检测到，足以引起形态学变化。(2) 在神经损伤条件下,脊髓背角初级传入投射结构可能发生

29、变化,例如A-纤维芽生至更多的背角髓板浅层，在那里可能接通伤害性感觉神经元37。 值得注意的是紧发条多见于髓板浅层(II)。(3) A-纤维伸至髓板浅层的再适应由表型开关调节,开始合成伤害性前递质(pronociceptive) 和兴奋性递质, P物质和血管活性肠肽，除了兴奋性氨基酸外。神经损伤和炎症后发现脊髓背角NK1受体上调，这调节P物质合成所导致的结果，从而强化紧发条38,39 。图2 皮肤、初级传入纤维输入至脊髓背角的组织通路（箭头所示为A-纤维芽生至背角髓板浅II层） 依据脊髓背角A-神经纤维的芽生机制，一些临床上治疗措施能减轻疱疹后神经性疼痛，如： (1)抗炎药即刻和完全减轻炎症，以阻止C纤维的反复激活和继发的脊髓背角髓层形态学改变。(2) 使用局麻药以阻止疼痛信号传递。 (3)通过鞘内注射抗增殖药来预防芽生。 (4) 使用NMDA受体和 NK1受体拮抗剂以阻止紧发条中枢机制的形成。一些临床试验已表明这些拮抗剂的有效性，但值得注意的是未来临床研究有必要验证这些假设。4. 热敏感性降低的受