水稻条纹病毒致病相关蛋白与宿主相互作用的研究 - 扬

1、RSV CP与植物和昆虫宿主互作的研究(赵淑玲 学号: D08037 导师: 梁建生教授)摘要:水稻条纹病毒(Rice stripe virus,RSV)引起的水稻条纹叶枯病对水稻生产造成了巨大损失，特别是近几年来该病连续爆发流行引起了人们的普遍关注，因此弄清RSV的致病机理和如何防治病害发生成为研究者迫切希望解决的问题。虽然目前RSV基因组功能方面有了一些初步研究，但是该病毒与宿主互作及病毒的致病机理还未有研究报道，病毒的侵染和致病机理还不清楚。RSV的衣壳蛋白（Capsid protein,CP）是一种多功能蛋白，在病毒的侵染、复制、运动和传播方面均起重要作用。因此本项目拟开展RSV CP

2、与植物和昆虫相互作用的研究，通过此项工作深入了解CP在病毒的致病及传播过程中所起的作用，同时还可对病毒的侵染机理以及病毒与宿主的相互作用有更深层次的认识，也为开展植物抗病毒基因工程的研究和应用奠定基础。关键词：RSV；衣壳蛋白；相互作用；侵染机理1. 研究背景及意义1.1 水稻条纹病毒的危害水稻条纹病毒(Rice stripe virus, RSV)是水稻条纹叶枯病的致病原，该病毒仅靠介体昆虫传播，其他途径不能传病。介体昆虫主要为灰飞虱，灰飞虱一旦获毒就可终身带毒并且经卵进行持久性传播。感染RSV的水稻发病初期病株心叶沿叶脉呈现断续的黄绿色或黄白色短条斑，以后常连成褪绿大片，使叶片一半或大半变

3、成黄白色。早期发病植株枯死，发病迟的只在剑叶或叶鞘上有褪色斑，但抽穗不良或穗畸形不实，病株分蘖一般减少。水稻条纹叶枯病最早于1897年在日本发现,在我国自1963年在苏南地区始发后,已经扩散到18个省市,特别是近几年来在江苏和河南连续暴发,造成了水稻生产上的巨大损失。该病害2001年在江苏、河南等地暴发流行，病田率达50%以上, 2004年再次大规模流行，病田率达75%以上,且自2004年来该病持续流行,对水稻生产构成了严重威胁1。1.2 水稻条纹病毒的基因组结构及功能RSV属于纤细病毒属( Tenuivirus)，基因组由4条单链RNA组成，共编码7个不同的功能蛋白(如图1所示)。除RNA1

4、采用负链编码策略, RNA2 RNA4均采取双义编码策略,即在RNA的毒义链( viral RNA, vRNA)和毒义互补链( viral complementary RNA, vcRNA )的靠近5端处各有一个开放阅读框(open reading frame, ORF) ,都可以编码蛋白质2,3,4,5。RSV RNA1采取负链编码策略，vcRNA1编码病毒的RNA聚合酶（RdRp）6。RSV RNA2正链编码一非结构蛋白NS2，目前NS2的功能还未知。序列分析表明，RSV vcRNA2编码的NSvc2蛋白与番茄斑萎病毒属（Tospovirus）病毒膜糖蛋白前体的氨基酸序列之间有相似性，推测

5、NSvc2为病毒的膜糖蛋白。Liang等7在灰飞虱唾液腺和中肠的上皮细胞中检测到NSvc2蛋白，且可以和SP在中肠中积累，形成纤维质状的电子质不透明内含体，而这种内含体在植物中几乎不存在。这意味着NSvc2蛋白和SP都有可能在病毒与昆虫介体的识别中起作用。RNA3正链编码的蛋白为RNA沉默抑制子，能够抑制植物、昆虫细胞和哺乳动物细胞的RNA沉默8，9。vcRNA3编码病毒的衣壳蛋白（CP），RNA4正链编码致病症状相关蛋白（SP）。许多研究结果已经揭示了衣壳蛋白（CP）和致病症状相关蛋白（SP）在病叶中的积累量与褪绿花叶症状的严重度密切相关,推测这两种蛋白都是致病相关蛋白10，11。明艳林等1

6、2发现CP和SP存在于受侵染水稻的叶绿体内,其浓度与病叶症状的严重度呈正相关，并且RSV粒体能够进行体外叶绿体跨膜运输研究,结果表明,病毒粒体能快速进入离体叶绿体。vcRNA4编码病毒的移动蛋白，Xiong等13通过实验证实NSvc4能够使缺失移动蛋白的PVX病毒恢复运动功能，从而从烟草的一个细胞达到另一个细胞，因此推测NSvc4蛋白是RSV的移动蛋白。 图1. RSV的基因组结构1.3 本项目立项依据和研究意义 水稻条纹叶枯病近几年来连续爆发流行，给水稻生产带来了严重的危害,因此如何防治病害发生及控制病害的流行成为研究者迫切希望解决的问题。虽然对RSV 基因功能进行了一些初步研究，但还有很多

7、基因的功能未知，特别是该属病毒的侵染和致病机理研究未深入，病毒致病的整个过程还不清楚。另外由于RSV是多片段的负链RNA病毒,不易建立侵染性克隆,因此目前还不能采用如缺失突变、片段重组等传统基因工程方法来研究其基因功能。这也给RSV基因功能的研究工作带来了困难，使得RSV的分子水平的研究未深入进行。植物病毒CP是根据它能包被病毒核酸使其壳体化而被命名，是病毒生命过程中的主要蛋白。除参与病毒粒体的构成外，CP在病毒复制、症状形成和传播过程中也有一定的功能。病毒要在宿主内增殖首先要进入宿主细胞，在这个过程中非包膜的病毒一般是通过外壳蛋白与宿主细胞表面的受体作用进入细胞。在寄主和介体的长期进化过程中

8、，假如寄主植物能在初期就对病毒的入侵作出防卫反应，那它们一般都是靠识别病毒CP作为分子信号来引发防卫机制的，研究表明植物病毒CPs的突变可以改变寄主的范围和寄主发病的症状特征。在运动方面，CP形成壳体可以保护病毒基因信息防止病毒发生退化，对于大多数植物病毒来讲，CP对于病毒在被侵染植物中的运动过程都是有重要作用的。另外，CP和SP存在于受RSV侵染水稻的叶绿体内,其浓度与病叶症状的严重度呈正相关，说明在RSV CP诱发植物症状形成方面也起着非常重要的作用综上所述，植物病毒的CP是一种多功能蛋白，在病毒的侵入、复制、运动、传播和诱发症状形成等过程均有CP的参与。因此本项目开展RSV CP与植物和

9、介体昆虫相互作用的研究，通过此项工作深入了解CP在病毒的致病及传播过程中所起的作用，同时还可对病毒的侵染机理以及病毒与宿主的相互作用有更深层次的认识，也为开展植物抗病毒基因工程的研究和应用奠定基础。2. 研究内容、研究目标以及拟解决的关键问题2.1 研究内容RSV是跨越动、植物两界的双宿主病毒， 病毒可以在灰飞虱体内增殖且能够借助虫卵传到后代，也可以在水稻中增值从而引发水稻条纹叶枯病。因此，本项目从两个方面来研究RSV 与宿主间的相互作用：一是RSV与植物宿主的相互作用，二是RSV和介体昆虫宿主的互作。在RSV与植物和昆虫宿主相互作用的过程中，CP均起重要作用，因此通过CP与宿主间互作的研究可

10、明确CP的功能，也为进一步阐明病毒的侵染机理奠定基础。 （1）RSV CP与水稻的相互作用本项目采用酵母双杂交系统来研究RSV CP与植物宿主之间的相互作用，即利用RSV CP从水稻cDNA文库中筛选与其互作的蛋白。由于水稻的研究开展的比较深入，全基因组序列已经测定完成，某些蛋白的功能也已明确，所以易对筛选出的蛋白进行功能分析，从而也可进一步阐明CP在病毒的致病过程所起的作用。利用酵母双杂交系统研究RSV CP与水稻宿主间的互作主要包括以下几个步骤： 水稻cDNA文库的构建要筛选与RSV CP互作的蛋白就要首先建立水稻cDNA文库。水稻条纹叶枯病发生程度在不同水稻品种之间的差异较大,一般糯稻发

11、病重于粳稻，籼稻发病最轻。我们选用对RSV比较敏感、发病程度较重的糯稻叶片作为构建水稻cDNA文库的材料。首先提取叶片总RNA, 分离mRNA，然后合成cDNA第一链和其互补链，最后连接到酵母双杂交的猎物质粒上，构建成了水稻的酵母双杂交cDNA文库。 从水稻cDNA文库中筛选与RSV CP互作的蛋白提取RSV基因组核酸，根据已发表的RSV基因组序列设计引物扩增cp基因，连接入酵母双杂交系统的诱饵质粒上。然后将诱饵质粒和猎物质粒共转化酵母，筛选相互作用的蛋白。由于可能出现假阳性的结果，因此我们用其它研究蛋白互作的方法来进一步验证筛选出的互作蛋白，如免疫共沉淀、GST-pull down等。 互作

12、蛋白的功能分析酵母双杂交得到的阳性克隆子质粒经过DNA测序，通过与NCBI数据库中，分析筛选出的其它序列比对分析基因的功能。如果是数据库功能未知的基因，首先要对基因编码的蛋白进行细胞定位，然后做进一步的功能研究，另外对筛选出的蛋白进行亚细胞定位也可为明确RSV CP的作用位点奠定基础。 （2）RSV CP与昆虫细胞的相互作用在植物病毒与介体昆虫相互作用方面研究比较多的是马铃薯Y病毒属（Potyvirus）的病毒。Potyvirus属病毒是通过蚜虫以非持久的方式传播的, Potyvirus能被蚜虫传播除了需要病毒的外壳蛋白外,还需要蚜传辅助因子(Helper component proteina

13、se, HC-Pro)。HC-Pro是一种非结构蛋白，其一端与病毒的CP互作，一端与蚜虫结合，在蚜虫口针与CP之间起桥联作用。辅助组分必须在获毒过程中或之前被蚜虫获得，这种辅助成分在非持久性和半持久性传播的大部分植物病毒中存在14。 对于持久、增殖性方式传播的植物病毒研究较少，近两年对水稻矮缩病毒（Rice dwarf virus, RDV）的研究取得了一些进展。RDV经叶蝉以持久的增殖性的方式传播，其病毒粒子由外、中、内三层衣壳组成，无包膜。研究表明RDV的其中一个衣壳蛋白P2是虫媒传染的关键蛋白，P2蛋白与包膜动物病毒编码的膜融合蛋白具有相同的结构特征。当RDV  P2蛋白被表达

14、出来，并出现在草地贪夜蛾(Spodoptera  frugiperda)  细胞表面时，这种蛋白就会在低pH值下诱导膜融合。说明RDV P2和包膜病毒糖蛋白一样具有膜融合的功能15。关于纤细病毒与介体互作的分子基础知之甚少。序列分析表明，RSV vcRNA2编码的NSvc2蛋白与番茄斑萎病毒属（Tospovirus）病毒膜糖蛋白前体的氨基酸序列之间有相似性，推测NSvc2为病毒的膜糖蛋白。Tospovirus病毒粒子外有包膜糖蛋白，然而迄今未发现RSV病毒粒体的包膜，RSV病毒粒体仅含一种外壳蛋白，CP的氨基酸序列分析结果表明其不具备膜糖蛋白的特征。那么NSvc2蛋白和CP

15、蛋白在RSV与昆虫介体的互作过程中各起什么作用呢？RSV NSvc2是否和其它的膜糖蛋白一样具有膜融合的功能呢？在病毒经昆虫介体传播的过程中是否也像PVY病毒一样需要一种非结构蛋白作为辅助因子，这种辅助蛋白是否就是NSvc2蛋白呢？所有这些问题答案还未知。因此本项目着重研究CP和 NSvc2蛋白在病毒侵染过程中所起的作用，从而逐步阐明病毒侵染介体昆虫的机制，为该病毒防治奠定基础。本项目拟从以下几个方面来初步研究RSV与昆虫细胞的相互作用：病毒通过介体昆虫的传播需要哪些蛋白参与；RSV NSvc2蛋白和CP是否具有膜融合功能；CP和NSvc2蛋白之间的相互作用。 参与介体昆虫传播的病毒蛋白利用杆

16、状病毒表达系统表达RSV的NSvc2蛋白，制备抗体，先检测提纯的RSV病毒粒子是否含有NSvc2蛋白。实验分两组：一组只用提纯的RSV病毒粒子喂饲灰飞虱；另一组将病毒粒子和杆状病毒表达的NSvc2蛋白混合后喂饲灰飞虱，然后PCR检测灰飞虱体内有没有RSV的存在，分析NSvc2蛋白是否是介体传毒的必需蛋白。 CP和NSvc2蛋白之间的相互作用。如果RSV 像Potyvirus属病毒一样需要辅助因子的话，那么辅助因子可能和病毒的衣壳蛋白互作，从而引导病毒粒子进入昆虫细胞。为了验证这一点，我们利用酵母双杂交系统来研究CP和NSvc2蛋白之间是否互作，如果有的话，通过缺失突变来确定作用位点。 CP和N

17、Svc2蛋白膜融合功能的研究根据序列分析的结果推测 RSV NSvc2蛋白为病毒的膜糖蛋白，这只是推测，是否具有这种功能还需要实验来验证。我们分别将编码CP、NSvc2蛋白的基因插入编码杆状病毒膜蛋白gp64信号肽和编码疱疹性口炎病毒(VSV)G蛋白跨膜结构域的基因序列之间,转染草地贪夜蛾sf9细胞,使目的蛋白表达并呈现在sf9细胞的膜表面。然后用倒置显微镜观察细胞融合的情况，从而判断CP、NSvc2蛋白是否具有膜融合的功能。2.2 研究目标（1） 筛选出与RSV CP互作的植物宿主蛋白（2） 探明RSV CP在病毒致病过程中的作用（3） 初步阐明RSV侵染昆虫细胞的的机理2.3 拟解决的关键

18、科学问题（1） RSV CP的功能（2） 阐明RSV的致病机理（3） 初步探明RSV通过介体传播的机制3. 拟采取的研究方法及可行性分析3.1 RSV CP 与水稻互作研究的路线图构建诱饵质粒构建猎物质粒扩增RSV cp基因构建水稻叶片cDNA文库共转化酵母细胞筛选与RSV CP互作的蛋白与NCBI库中基因序列比对，推测互作蛋白的功能序列测定？互作蛋白的细胞定位进一步功能研究 图2. RSV CP与水稻互作研究的路线图3.2 主要研究方法(1) 水稻酵母双杂交cDNA文库的构建cDNA文库是指细胞全部mRNA逆转录成cDNA并被克隆的总和，代表生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内转录水平上的

19、基因的群体，并不能包括该生物的全部基因。cDNA文库构建步骤主要为：细胞总RNA的提取和mRNA的分离；第一链cDNA合成；第二链cDNA合成；双链cDNA克隆连接载体质粒并导入宿主菌中繁殖。cDNA文库构建的实验流程图如图3所示。组织总RNA提取mRNA分离Oligo(dT)引导合成cDNA第一链置换合成法合成cDNA第二链连接接头载体质粒提取质粒酶切消化DNA与载体连接转化大肠杆菌鉴定文库的克隆数和特性筛选出所需的克隆扩增后供长期储存 图3. cDNA文库构建的实验流程图(2) 利用酵母双杂交系统从水稻叶片cDNA文库中筛选互作的蛋白真核基因表达时，转录因子（蛋白质）必须同基因上游的特异性

20、序列结合才能激活RNA 聚合酶将基因拷贝成RNA。转录因子有两个重要的功能区域。一个负责与启动子上游的调控序列结合，另一个负责转录过程的激活。在酵母双杂交体系中，编码这两个结构域的DNA片断分别被构建在两个独立的表达载体上，一个表达载体包含转录因子的DNA结合结构域基因片段与待研究的抑制蛋白质编码序列形成的融合基因，另一个表达载体包含转录因子激活结构域与许多未知的cDNA连接形成的融合基因。这两种表达载体共处于同一酵母细胞时将表达产生两种融合蛋白。如果与DNA结合区域融合的蛋白质同与激活区域融合的蛋白质之间存在互作关系便会形成复合体，可以启动报告基因的表达过程。酵母双杂交系统的原理和实验流程分

21、别如图4和图5所示。 图4. 酵母双杂交系统原理图 图5. 酵母双杂交的基本实验过程(3) 蛋白的亚细胞定位研究研究蛋白在细胞中的定位首先可根据用生物信息学软件预测该蛋白在细胞内的定位,但是这种预测结果不是结论性的,需要实验来验证。绿色荧光蛋白(GFP)是一种发光蛋白，其编码基因gfp作为一种新颖的非酶性标记基因具有许多优点：检测方便, 只需要荧光显微镜或激发光源; 材料无需前处理, 可以活体检测; 无需任何底物或辅助因子; 对细胞本身几乎无毒; 植物本身不含有GFP,不会出现假阳性; 由于GFP分子量较小, 不影响与其融合的蛋白的生物学活性, 所以GFP在研究蛋白的亚细胞定位方面是一个很好的

22、工具。本课题中将GFP用于目的蛋白的亚细胞定位研究，将GFP编码序列融合到目的基因的编码序列的5端或3端，然后连接入植物表达载体，转化水稻原生质体或转化植株，用激光共聚焦显微镜对细胞进行激光断层扫描以采集细胞内绿色荧光的分布信号，并用计算机软件进行成像处理，最后获得目的蛋白在细胞内的定位信息。（4） 杆状病毒表达载体的构建及蛋白的表达利用杆状病毒表达系统研究目的蛋白的膜融合功能参照Zhou等所采用的方法15。gp64蛋白是杆状病毒的囊膜糖蛋白，可诱导相邻细胞间的膜融合，从而使成熟的病毒粒子从一个细胞感染另一细胞。gp64的信号肽具有跨膜的功能，可以使其携带的蛋白穿过细胞膜分泌到细胞外。疱疹性口

23、炎病毒（VSV）的G蛋白也是囊膜糖蛋白，其跨膜结构域可使与其相连的肽锚定于膜上。我们将NSvc2蛋白前端连接gp64的信号肽序列，后端连接VSV G蛋白的跨膜结构域， gp64的信号肽可以引导NSvc2蛋白穿过细胞膜，而后端连接的VSV G蛋白跨膜结构域又可使其后端固定于细胞膜膜上，这样NSvc2蛋白便成功展现在了昆虫细胞膜上，以利于研究其膜融合的功能（如图6所示）。gp64 spCP/NSvc2VSV G tm图6. 构建CP或NSvc2蛋白的细胞膜锚定载体将上述构建好的供体质粒转入含有Bacmid的大肠杆菌,通过转座使外源基因插入到Bacmid中，然后提取质粒，PCR鉴定是否含有插入的外源

24、基因。随后将鉴定好的含有目的基因的Bacmid转染昆虫细胞sf9,使其在昆虫细胞中表达。一定时间后收集细胞，提取蛋白，Western Blot检测目的蛋白的表达情况（如图7所示）。（5） 蛋白膜融合功能的研究方法我们用荧光免疫方法检测目的蛋白是否呈现在了昆虫细胞的膜上。重组病毒感染sf9细胞一定时间后收集感染的细胞，加入制备的RSV CP或NSvc2蛋白的抗体，结合后洗几次再加入连接有TRITC的二抗，激光共聚焦显微镜下观察目的蛋白在细胞膜表面的表达。TRITC为四甲基异硫酸罗丹明，是一种荧光素，激发后出现橙红色荧光。若目的蛋白表达后呈现在细胞膜的表面则在激光共聚焦显微镜下细胞的表面出现橙红色

25、荧光。观察膜）培养,一定时间后倒置显微镜下观察合胞体形成情况,从而判断细胞是否发生了融合。整个实验过程见图8。Western Blot检测目的蛋白的表达扩增cp基因片段扩增编码gp64 sp的片段连接形成gp64 -cp扩增VSV tm连接形成gp64-cp-VSV tm供体质粒pFastBac连接形成pFastBac-cp转入含Bacmid的大肠杆菌筛选,PCR鉴定提取Bacmid质粒,转染昆虫sf9细胞加入抗CP的一抗加入耦联有TRITC的二抗收集细胞，低pH条件下诱导融合激光共聚焦显微镜检测目的蛋白在膜表面的表达几分钟后转到正常pH下培养显微镜下观察细胞融合图8. 研究CP蛋白的膜融合功

26、能的路线图 图7.利用杆状病毒表达系统表达外源蛋白的基本实验过程4. 本研究的特色及创新之处（1） 本项目首先开展了RSV病毒与植物宿主相互作用研究，通过此项研究工作为初步阐明病毒的致病机理奠定基础。（2） 本项目初次进行了RSV侵染昆虫机理的研究工作，在分析RSV蛋白功能结构域和其它病毒侵染的机理的基础上，我们进行了大胆的假设，并想通过实验验证这一假设。本项工作的开创性很强，对于进一步阐明该病毒的侵染机理有重要的推动作用。（3） 本项目在研究病毒与昆虫细胞互作时借用了杆状病毒表达载体和昆虫细胞sf9将待研究蛋白呈现在了昆虫细胞的膜上，运用此种方法十分清晰明了的显示蛋白的膜融合功能。5. 年度

27、研究计划及预期研究成果（1） 年度研究计划研究工作预定三年完成，基本所有工作都可以全年进行，不受季节限制。第一年， 着重研究RSV CP与水稻的相互作用构建水稻的cDNA文库，利用CP从水稻cDNA文库中钓出与之互作的蛋白，然后利用其它方法验证蛋白间的相互作用。同时也进行RSV CP与NSvc2蛋白间互作的研究工作。第二年， 对水稻cDNA文库中与CP互作的蛋白进行功能分析对互作的蛋白进行功能分析，亚细胞定位。第三年， 研究RSV侵染昆虫细胞机制分别构建CP、NSvc2的杆状病毒表达载体，转染昆虫细胞，研究目的蛋白的膜融合功能。（2） 预期研究成果 构建好水稻cDNA文库; 探明RSV CP与

28、水稻互作的位点以及其在病毒致病过程中作用; 初步阐明RSV侵染介体昆虫的机制。6. 主要参考文献目录1 吴书俊，钟环，左慧等.水稻条纹病毒分子生物学与抗病毒基因工程研究进展.江西农业学报，2006，18（4）：7277. 2 Toriyama S, Takahashi M, Sano Y, et al. Nucleotide sequence of RNA1, the largest genomic segment of rice stripe virus, the prototype of the tenuiviruses. Journal of General Virology, 1994

29、, 75: 35693679.3 Kakutani T, Hayano Y, Hayashi T, et al. Ambisense segment 4 of rice stripe virus: possible evolutionary relationship with phleboviruses and ukuviruses (Bunyaviridae). Journal of General Virology, 1990, 71(7): 14271432.4 Kakutani T, Hayano Y, Hayashi T, et al. Ambisense segment 3 of

30、rice stripe virus: The first instance of a virus containing two ambisense segments. Journal of General Virology, 1991, 72(2): 465468.5 Takahashi M, Toriyama S, Hamamatst C, et al. Nucleotide sequence and possible ambisense coding strategy of rice stripe virus RNA segment 2. Journal of General Virology, 1993, 74(4): 769773.6 Toriyama S. Rice stripe virus: prototype of a new group of viruses that replicate in plants and insects. Microbiological Sciences, 1986,3: 347351.7 Liang D L, Qu Z C, Ma X Q. Detection and Localization o