细胞免疫荧光

1、DAPIDAPI即4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole)，是一种能够与DNA强力结合的荧光染料，常用于荧光显微镜观测。因为DAPI可以透过完整的细胞膜，它可以用于活细胞和固定细胞的染色。在荧光显微镜观察下，DAPI染剂是利用紫外光波长的光线激发。当DAPI与双股DNA结合时，最大吸收波长为358nm，最大发射波长为461nm，其发散光的波长范围含盖了蓝色至青绿色。DAPI也可以和RNA结合，但产生的荧光强度不及与DNA结合的结果，其发散光的波长范围约在400nm左右。DAPI的发散光为蓝色，且DAPI和绿色荧光蛋白(Gree

2、n fluorescent protein, GFP)或Texas Red染剂(红色荧光染剂)的发散波长，仅有少部分重叠，研究员可以善用这项特性在单一的样品上进行多重荧光染色。DAPI能快速进入活细胞中与DNA结合，因此DAPI对生物体而言，也被视为一种毒性物质与致癌物。使用过程中应注意操作与抛弃的处理程序。染色原理：DAPI 为一种荧光染料，可以穿透细胞膜与细胞核中的双链DNA结合而发挥标记的作用，可以产生比DAPI自身强20多倍的荧光，和EB相比，对双链DNA的染色灵敏度要高很多倍。显微镜下可以看到显蓝色荧光的细胞，荧光显微镜观察细胞标记的效率高(几乎为100 %) 。DAPI染色常用于细

3、胞凋亡检测，染色后用荧光显微镜观察或流式细胞仪检测。DAPI也常用于普通的细胞核染色以及某些特定情况下的双链DNA染色。细胞经热激处理后用DAPI染色3分钟，在荧光显微镜下可以看到到细胞核的形态变化。a、 正常的烟草细胞核：核形完整，染色质均匀。b、染色质固缩，向外周聚集，形成周边化。c、 染色质进一步固缩，形成很多颗粒物质。d、 细胞核破裂形成碎片，核解体。染色步骤编辑在细胞移植前，将DAPI 以一定的浓度加入培养基中，与细胞共同孵育过夜，用PBS 缓冲液漂洗至少6 次以洗掉未结合的DAPI，再用酶消化后离心收集细胞，加入DMEM 培养基制成细胞悬液以备用。存储条件：-20避光保存每次使用，

4、用量较少，可反复冻融，无需分装注意事项：1、DAPI强烈致癌，操作时要戴上手套。2、贮存液用70%酒精配制，浓度100 g/ml，可用黑纸包住，长期冻存。使用液按1:1000用PBS稀释，最终浓度100 ng/ml。3、DAPI是非常优秀的DNA染料，固定过和没有固定过的活细胞均可用DAPI染色。FAM(羧基荧光素)分子式：C21H12O7分子量：376.32别 名：5-FAM结构式：5-Carboxyfluorescein性状：溶于水,溶于DMSO和DMF贮存：20°C干燥避光保存用途：5-FAM主要应用于DNA自动测序中，标记其中的d/ddCTP（三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸、 2&#

5、39;,3'-双脱氧胞嘧啶三磷酸），也经常用于PCR产物定量，核酸探针等。 FAM梭基荧光素(carbox州uorescein)是荧光素 衍生物的一种,其中5一FAM(carbox姆uorescein一 sueeimidvlester),广泛存在于荧光标记试剂盒(Ap- plied Bio叮stems Co甲oration,AmpF比声脯ler Rus翎,PeRA呷li6eation Kit User乞Manual;Prome罗 Co甲oratoin,Gene而ntTM PowerPlexTM,1.2 System Technic以Manual)。FAM与氨基反应快速,产物也更 稳定,

6、适用于氢离子激光(Argon一ionl丑ser)的 488nm光谱线,Abs/Em=492/slsnm(pH=9.0), 具有荧光素衍生物的普遍特性,在水中稳定。FITC（异硫氰酸荧光素）异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate, FITC) FITC纯品为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水和酒精溶剂。有两种异构体，其中异构体型在效率、稳定性与蛋白质结合力等方面都更优良。FITC分子量为389.4，最大吸收光波长为490495nm，最大发射光波长为520530nm，呈现明亮的黄绿色荧光。FITC在冷暗干燥处可保存多年，是目前应用最广泛的荧光素。其主要优点是人眼对黄绿色较

7、为敏感，通常切片标本中的绿色荧光少于红色。蛋白荧光标记试剂，也是医学诊断药物，主要用作荧光抗体技术中的荧光染料，能和各种抗体蛋白结合，结合后的抗体不丧失与一定抗原结合的特异性，并在碱性溶液中具有强烈的绿色荧光。用于医学，农学和畜牧等方面，可对由地细菌病毒和寄生虫等所致疾病进行快速诊断。5-FITC FITC Isomer I; fluorescein-5-isothiocyanate 异硫氰酸荧光素3326-32-7C21H11NO5S389.38 用于标记蛋白，28°C保存50 mgusing ASF (a nuclear speckle marker) 核斑纹标记（1）荧光素类&

8、#160; Fluorescein   标准荧光素（Reference standard）之一,在其基础上进行结构改造,可产生一系列荧光素衍生物。   Fluorescein适用于Argon-ion Laser的488nm光谱线，有相对高的荧光吸收，较好的荧光产率以及良好的水溶性。标记蛋白时通常不会产生蛋白沉淀。   与其他荧光素类衍生物一样，Fluorescein具有光淬灭率高，pH敏感性强与发射波谱宽的缺点。   主要应用于聚焦激光扫描微阵列

9、（Confocal laser scanning microscopy）和流式细胞计应用（Flow cytometry）。 FITC   异硫氰酸荧光素，Fluorescein isothiocyanate，是荧光素衍生物的一种，5-FITC较6-FITC更经常使用。   FITC的异硫氰酸基能与氨基反应，可用于标记氨基修饰DNA，一旦形成，产物极为稳定。适用于Argon-ion Laser的488nm光谱线，Abs/Em=492/519nm（pH=9.0）。与蛋白

10、的结合力也强。   FITC具有荧光素衍生物的普遍特性。在水中易变坏，不能长久保存。   FITC-Oligo 广泛用于杂交探针；FITC-多肽用于Edman降解蛋白测序；FITC也经常被用于蛋白电泳检测（即使是毛细管电泳）和荧光能量激发转移测试。 FAM   羧基荧光素，Carboxyfluorescein，是荧光素衍生物的一种，5-FAM较6-FAM更经常使用。   Carboxyfluorescein-5-succimidyl ester，

11、即5-FAM（NHS）广泛存在于荧光标记试剂盒。 与FITC相比，FAM与氨基反应更快，产物也更稳定，但FITC结合蛋白的量更大且进程更易于控制。   FAM也适用于Argon-ion Laser的488nm光谱线，Abs/Em=492/518nm（pH=9.0），具有荧光素衍生物的普遍特性，在水中稳定。   5-FAM主要应用于DNA自动测序中，标记其中的d/ddCTP（PE公司），也经常用于PCR产物定量，核酸探针等。 TET   四氯荧光素，Tetrachloro

12、60;fluorescein，是荧光素衍生物的一种。   TET以及HEX均是在FAM基础上加以改进的，氯原子使FAM的Abs与Em值都产生一定的红移，并在一定程度上减弱了pH敏感性。TET也适用于Argon-ion Laser激发光源，Abs/Em=521/536nm 。   TET，HEX，FAM和TAMRA可配合用于DNA自动测序中，其中TET用于标记d/ddATP，HEX用于标记d/ddGTP或d/ddATP（PE公司）   HEX   六氯荧光素

13、，Hexachloro fluorescein，是荧光素衍生物的一种。适用于Argon-ion Laser激发光源，Abs/Em=535/556nm。（请参见TET介绍）   JOE   羧基-4',5'-二氯-2',7'-二甲氧基荧光素，Carboxy-4',5'-dichloro-2'，7'-dimethoxyfluorescein，是荧光素衍生物的一种，6-JOE更被广泛使用。   JOE荧光产量高，pH敏感性弱，适

14、合于标记蛋白。6-JOE也适合于Argon-ion Laser激发光源，Abs/Em=520/548（pH=9.0）   常用于DNA自动测序，标记d/ddATP，也经常被用于进行电泳检测与PCR产物定量。 （2）罗丹明类（Rhodamine dye）  R 110   标准荧光素（Reference standard）之一,在其基础上进行结构改造,即可产生一系列罗丹明类衍生物。   与Fluorescein类衍生物相比，罗丹明类荧光素

15、具有更强的光稳定性，更高的荧光产量以及更低的pH敏感性   罗丹明类荧光素极为适合于标记寡核甘酸，但蛋白会引起大多数罗丹明类荧光素的荧光淬灭，故大多数不适宜用于标记蛋白。   R110被用于DNA自动测序。 TAMRA   全称羧基四甲基罗丹明，即Carboxytetramethylrhodamine，是罗丹明类荧光素衍生物，6- TAMRA被广泛使用。   TAMRA是少数几个能用于标记蛋白的，6- TAMRA适用于Argon-ion 

16、;Laser激发光源，Abs/Em=547/573nm（Ph=8.0），6-TAMRA（NHS）常用于荧光标记试剂盒中。   6- TAMRA主要用于DNA自动测序中。 Texas Red   Texas Red是一个长波长荧光素,与Fluorescein几乎没有波谱重叠,只适合于Ar-Kr Laser的568nm光谱线或He-Ne Laser的594光谱线,比Tetramethylrhodamine和LissamineTM Rhodamine B波长更长

17、，荧光量更高。   Texas Red在荧光微阵列和流式细胞计中更被经常作为第三波长标记(Third labels)。 （3）BODIPY类    BODIPY类荧光素是由分子探针公司开发，以用来替代那些有部分缺陷的传统荧光素，普遍具有荧光产量高，pH敏感性低（无离子变化），光稳定性强以及发射波谱窄的优点，故BODIPY类荧光素已被广泛用于核酸，脂肪酸，磷脂以及各种受体。同时，由于在电泳过程中对序列片段影响小，故已被逐渐用于DNA自动测序。但相对而言, BODIPY类荧光素并不特别适合

18、标记蛋白.   BODIPY FL可代替Fluorescein   BODIPY R6G可代替Rhodamine 6GBODIPY TMR可代替Tetramethylrhodamine   BODIPY TR可代替Texas Red   这些BODIPY类荧光素具有与被替代物几乎类似的光谱特征，能共用同样的光过滤器与激发光源，但更具优点。 （4）其他荧光素  Cascade blue   Cascade blue是在芘 (pyrene)结构基础上改造得来的,即sulfonated pyrene,它是一种短波长紫外激发荧光素,与另一种常用的紫外荧光素Aminocoumarin相比,Cascade blue的Em与Fluorescein有更小的光谱重叠,有更高的荧光吸收和更