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文档简介

1、0引言鸭肝炎病毒(Duck hepatitis virus ,DHV 是鸭病毒性肝炎(Duck viral hepatitis ,DVH 的病原。DVH 是雏鸭的一种急性和高度致死性传染病,其特征是发病急,传播快,病死率高,自然暴发仅发生于雏鸭,尤其是13周龄雏鸭,成年鸭具有抵抗力,临床主要表现为肝脏肿大和出血,该病常给养禽业造成重大经济损失。鸭肝炎病毒(DHV 有3种血清型,分别为DHV-型、型和型。I 型DHV 最早于1945年由Levine 在美国发现1,呈世界分布,型分布于英国,型分布局限于美国2-3。中国主要流行的是型鸭病毒性肝炎4,也偶有型DHV 发现的报道5。近年,国内外相继报道

2、了DHV-型的变异株6-8,与型、型鸭肝炎病毒无血清学交叉免疫反应的DHV-型的变异株被称为新型鸭肝炎病毒(NDHV。I 型DHV 属于小RNA 病毒科(Picomaviridae 肠型鸭肝炎病毒(DHV-在鸡胚中的增殖及感染力的测定马双羽1,丁毅1,2,文力正2,袁宝2,任文陟2(1吉林大学畜牧兽医学院,长春,130062;2吉林大学实验动物中心,长春,130062摘要:为确定所分离型鸭肝炎病毒(DHV-毒力,为DHV 单克隆抗体研究做好前期准备。将型鸭肝炎病毒接种于9日龄SPF 鸡胚尿囊腔(0.2mL/胚进行增殖,制备鸡胚成纤维细胞(CEF ,并分别运用鸡胚半数致死量(CELD 50法和组

3、织培养半数感染量(TCID 50法测定DHV 的感染力。结果显示,DHV-在SPF 鸡胚内成功增殖,致死鸡胚具有典型临床症状和体表特征,所增殖病毒的CELD 50和TCID 50分别为10-5.6/0.2mL 和10-5.12/0.1mL 。结果表明,该分离毒株毒力较强,是进行DHV 单克隆抗体研究的理想抗原。文献标志码:A论文编号:2010-2541Proliferation and Infectivity of Duck Hepatitis Virus Type (DHV-Ma Shuangyu 1,Ding Yi 1,2,Wen Lizheng 2,Yuan Bao 2,Ren Wenz

4、hi 2(1College of Animal Science and Veterinary Medicine ,Jilin University ,Changchun 130062;2Laboratory Animal Center ,Jilin University ,Changchun 130062Abstract:For the preparation of Duck Hepatitis Virus type (DHV-Monoclonal Antibody,and to determine the DHV virulence.In this study,the proliferati

5、on of Duck Hepatitis Virus Type was based on SPF Chick Embryo.Preparation of chicken embryo fibroblasts (CEF,CELD 50and TCID 50were used tostronger,and it was an ideal antigen for Monoclonal Antibody to against DHV.Key words:DHV-;SPF chick embryo;CELD 50;TCID 50基金项目:吉林省科技平台建设项目“吉林省实验动物质量检测中心平台建设”(20

6、071138和吉林大学农学部2007年度青年基金资助项目。第一作者简介:马双羽,女,1990年出生,陕西省宝鸡市人,吉林大学畜牧兽医学院2008级动物科学专业本科生。Tel :0431-*,E-mail :happy08yuyu 。通讯作者:文力正,男,1976年出生,甘肃省庆城县人,讲师,硕士,研究方向为动物遗传育种和实验动物质量检测。通信地址:130062吉林省长春市西安大路5333号吉林大学实验动物中心。Tel :0431-*,E-mail:wlzsydw 。收稿日期:2010-08-27,修回日期:2010-09-19。中国农学通报2011,27(03:352-355Chinese A

7、gricultural Science Bulletin马双羽等:型鸭肝炎病毒(DHV-在鸡胚中的增殖及感染力的测定1.2.1DHV 在SPF 鸡胚中的增殖选择9日龄SPF 鸡胚30枚。接种前照蛋检查,剔除死胚及弱胚。用碘酊和75%酒精消毒接种部位,在无菌环境中将用0.85%无菌生理盐水100倍稀释后的DHV 病毒液接种于鸡胚尿囊腔,0.2mL/胚,用石蜡封孔。 接种DHV 后的鸡胚置于孵化温箱中培养,控制相对湿度为60%,温度为37.5左右,每日翻蛋2次,每天照蛋,弃去24h 内死亡鸡胚,收集2496h 内死亡鸡胚,超过96h 不死亡鸡胚弃去。 无菌条件下用碘酊和75%酒精消毒鸡胚气室部位,

8、去除气室蛋壳、壳膜和尿囊膜,然后吸出透明的尿囊液,-20冻存。小心取出死亡鸡胚,观察其形态变化。1.2.2DHV 感染力的测定将含有DHV 的SPF 鸡胚尿囊液超滤除菌,连续进行10倍的梯度稀释,即10-1、10-2、10-310-8,共8个不同稀释度,将各个稀释度的病毒悬液分别接种9日龄SPF 鸡胚,每个稀释度接种8枚,0.2mL/枚,设对照胚3枚,接种0.2mL 0.85%的无菌生理盐水。观察记录鸡胚死亡情况,弃去24h 内死亡鸡胚,记录18天内死亡鸡胚数。按Reed-Muench法计算鸡胚半数致死量(CELD 509。取10日龄SPF 鸡胚,无菌操作下取出鸡胚,去除鸡胚头、四肢及内脏,剪

9、碎,消化,加入DMEM 营养液,置于375%的CO 2培养箱中培养,待24h 后长满单层时即可接种病毒。将含有DHV 的SPF 鸡胚尿囊液超滤除菌,用Hanks 液连续进行10倍的梯度稀释至10-10,共10个稀释度。将病毒接种到96孔微量培养板中,每一稀释度接种一纵排共8孔,每孔接种100µL 。在每孔加入细胞悬液100µL ,设正常细胞对照,于375%的CO 2培养箱中继续培养,观察5天并逐日记录结果,按Reed-Muench 法计算组织培养半数感染量(TCID 509。2结果与分析2.1DHV 的增殖及致死鸡胚形态DHV 病毒共接种30枚鸡胚,除2枚鸡胚于接种24h

10、内由于污染死去外,共收获2496h 内死亡28枚,每枚收获带毒尿囊液38mL 。尿囊液病毒经电镜观察可见直径2040nm 的类球状病毒(图1。DHV 致死鸡胚具有典型临床症状和体表特征,胚胎发育迟滞、蜷缩,全身水肿,体表充血,头颈和背部有出血点(图2,3。2.2DHV 感染力测定结果DHV 鸡胚半数致死量(CELD 50实验结果见表1。图1DHV的电镜照片 图2DHV 致死鸡胚左为DHV 致死鸡胚;右为正常鸡胚图3DHV 致死鸡胚与正常鸡胚的对比··353CELD50=10-5.6/0.2mL,表明将DHV病毒稀释105.6倍,接种200µL可使50%的鸡胚致死。

11、制备并培养CEF细胞(见图4,接种感染DHV病毒(见图5,组织培养半数感染量(TCID50实验结果见表2。TCID50=10-5.12/0.1mL,表明将该病毒稀释105.12倍接种100µL,可使50%的CEF细胞发生病变。病毒液稀释度 死胚数活胚数累计死胚数活胚数累计死胚率/%表1DHV的鸡胚半数致死量(CELD50测定结果注:死胚数为当前稀释度下的死胚数;累计死胚数为到目前稀释度为止,累计死胚数;累计死胚率为当前稀释度下累计死胚数与总胚数的比率。图4正常CEF照片图5感染DHV的CEF照片表2DHV的组织培养半数感染量(TCID50测定结果注:CPE:Cytopathic ef

12、fect(细胞病变。病毒液稀释度 CPE孔数无CPE孔数累计CPE孔数无CPE孔数累计CPE比率/%3讨论型DHV可以在810日龄鸡胚或1014日龄鸭胚中增殖。初代分离一般使用鸭胚,在经鸭胚盲传若干代后一般能适应鸡胚。虽然鸭胚接种要比鸡胚敏感,而且产毒量也明显高于鸡胚12,但由于中国目前尚无SPF鸭场,而且鸭胚中往往含有母源抗体抑制DHV的增殖,所以在实验中大多用SPF 鸡胚进行病毒增殖。杨萍萍 13报道,DHV致死鸭胚的胚肝、胚膜和胚体中的病毒含量均高于尿囊液,建议病毒增殖后可以收获上述材料。自发现鸭肝炎病毒以来,国外许多学者对该病毒的细胞培养进行了研究,但直到Wcocock1982年发现胎

13、牛血清中存在着鸭肝炎病毒非特异性抑制物后,病毒的细胞培养工作才有了较大的进展。陈琨141994年··354马双羽等:型鸭肝炎病毒(DHV-在鸡胚中的增殖及感染力的测定首先用鸭胚肝细胞培养了鸭肝炎病毒,认为鸭肝炎病 毒对鸭胚肝细胞敏感。现在一般认为,弱毒株对细胞增殖的适应性强于野生株,鸭胚细胞强于鸡胚细胞,肝细胞优于成纤维细胞。刘健15研究新型DHV在鸭胚肝细胞的培养时发现,当病毒接种于面积较大的容器,如细胞瓶中时,细胞不易贴壁,很容易观察到细胞破碎脱落;在面积很小的6孔细胞培养板上则很容易贴壁,且易观察到病变细胞的颗粒变性和萎缩脱落。新型DHV病毒不同代次细胞培养的毒力之间

14、没有明显变化,而用鸭胚成纤维细胞增殖DHV,到第三代基本没有细胞病变,认为鸭胚成纤维细胞不适用于鸭肝炎病毒的培养。杨萍萍13发现不同株系对鸡胚成纤维细胞和鸡胚肝细胞的适应性不同,鸡胚肝细胞要比鸡胚成纤维细胞敏感得多。结果显示,分离DHV毒株的CELD50和TCID50分别为10-5.6/0.2mL和10-5.12/0.1mL,表明该毒株毒力较强,是进行DHV单克隆抗体研究的理想抗原,为下一步的实验研究奠定了基础。参考文献1Levine P P,Hofstand M S.Duck disease inverstigationM.AnnuRep New York state vet.coli:Lt

15、haca,1945:55-56.2Asplin F D,Mclauchlan J D.Examination of sera from wild fowlforantibodies against duck hepatitis virusJ.Vet.Rec.,1954,66:456-458.3唐桂运,武华主,冀锡霖.禽病原分离鉴定实验室手册,3版,M.北京:北京农业大学出版社,1993:190-194.4王勇,李广兴,刘思国.鸭病毒性肝炎研究进展J.畜牧兽医科技信息,2007(3:7-9.5刘兆宇,程安春.雏鸭病毒性肝炎的研究进展J.中国家禽,2002,24(10:6-9.6Sanhu T S

16、,Calnek B W,Zcman L.Pathologic and serologiccharacterization of a variant of Duck hepatitis of type1virusrJ.Avian Dis,1992,36:932-936.研究J.中国畜禽传染病,1996,(4:14-17.8郑献进,张大丙.曲丰发,等.I型鸭肝炎病毒变异株的鉴定J.中国兽医杂志,2006,42(5:15-16.9殷震,刘景华.动物病毒学,2版M,北京:科学出版社,1997:510-511,330.10Kim M C,Kwon Y K,Joh S J,et a1.Molecular analysis of Duckhepatitis virus type1reveals a novel lineage close to the genusParechovirus in the family PicornavdeaJ.Journal ofGeneralVirology,2006,87:3307-3316.11Tseng C H,Knowles N J,Tsai N J,et a1.Molecular analysis ofDuck hepatitis virus type1indicates that it should be assignedto anew genur

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