自体髂骨复合PRF修复牙槽嵴裂的实验研究

1、自体髂骨复合PRF修复牙槽嵴裂的实验研究    摘要目的：将富血小板纤维蛋白（Platelet-rich fibrin，PRF）应用于牙槽嵴裂植骨手术，验证其是否能够减少植骨术后的骨吸收。方法：812月龄犬8只，以外科手术的方法制备双侧牙槽嵴裂模型，随机于两侧同期植入自体髂骨（对照组）及自体髂骨混合PRF（实验组）。于术后当日、2个月、4个月时拍摄上颌骨CT，利用三维重建软件测量植骨区体积，计算骨吸收率。结果：术后2个月、4个月时实验组的骨吸收率明显小于对照组，行配对样本的t检验，P<0.01。结论：将PRF加入自体髂骨进行骨移植修复犬的牙槽嵴裂，

2、在术后4个月的时间范围内，可以减少术后的骨吸收。 关键词富血小板纤维蛋白；牙槽嵴裂植骨；三维重建；骨吸收率 中图分类号R782 文献标识码A 文章编号1008-6455（2013）01-0024-02 Experimental study on autologous iliac bone transplantation combined with PRF ZHOU Long，FENG Xing-hua，LU Bin （Department of Oral and Maxillofacial Surgery，School of Stomatology，The Forth Military Med

3、ical University， Xi'an 710032，Shaanxi，China） Abstract： Objective We grafted the platelet-rich fibrin（PRF） mixed with autogenous iliac bone in the alveolar cleft and evaluated the bone resorption after operation. Methods 8 dogs（812 months） were created bilateral alveolar cleft by surgical operati

4、on. autogenous iliac bone（control group） and the PRF mixed with autogenous iliac bone（PRF group） were implanted into the defect of one side randomly and bone regeneration was investigated 2 months and 4 months after implantation. Results The bone resorption of the PRF group was lower than that of th

5、e control group at 2 months and 4 months，PKey words：platelet-rich fibrin（PRF）；alveolar bone grafting；three-dimensional reconstruction；bone resorption 牙槽嵴裂二期植骨手术对于大多数牙槽嵴裂的患者，是一种有效的治疗方法1，也是唇腭裂序列治疗的重要组成部分2。临床上常用的办法是取自体松质髂骨，制备成骨块，游离移植到牙槽嵴裂骨缺失的部位。这一手术很大程度上解决了牙槽嵴裂患者牙槽嵴形态不完整、恒牙无法正常萌出、唇鼻外形塌陷畸形等诸多问题，也能为之后的牙列

6、修复治疗提供必要的条件。然而，临床医生们发现植入的骨组织并不能完全成活，或多或少的伴有骨吸收的发生。为此，学者们不断探索加速骨生长，减少骨吸收的办法。Eriko Marukawa等3将富血小板血浆 （platelet-rich plasma，PRP）与自体髂骨复合移植修复牙槽突裂，发现这一方法能够减少植骨术后的骨吸收。富血小板血浆（PRP）含有大量血小板并且能够释放PDGF、TGF-以及VEGF等多种生长因子促进骨形成。2006年由法国学者Choukroun等4-6报道了一种新的血小板富集方法：富血小板纤维蛋白（Platelet-rich fibrin，PRF），这种方法与富血小板血浆（PRP

7、）的制备相比，不需要抗凝剂也不需要凝血酶，使得它的应用更加安全和简便。学者们将富血小板纤维蛋白（PRF）应用于牙周、种植等领域的疾病治疗中，发现PRF有很好的促进骨形成的特性7-9。本实验旨在研究将PRF引入牙槽嵴裂植骨手术是否能促进术后的骨生长、减少骨吸收。 1 材料和方法 1.1实验动物及动物模型：本实验参照杨雁等10犬的单侧牙槽嵴裂即刻植骨模型的方法，设计双侧牙槽嵴裂植骨模型。选用犬8只，性别不限，年龄812月龄，体重1015Kg，所有试验犬均体健，牙列完整，咀嚼功能正常。实验采用同体对照的方法，随机设置同一只动物的左侧或右侧为实验组，另一侧为对照组。实验组：植入PRF与自体髂骨的混合物

8、；对照组：仅植入自体髂骨。由于杨雁等12已验证这种模型制备方法，故未设置空白对照。 1.2手术步骤 1.2.1 PRF的制备：术前髂部及颈部备皮，禁食水6h，称重，肌肉注射速眠新0.1ml/Kg及3%戊巴比妥钠0.5ml/Kg麻醉。仰卧位固定，充分显露颈部，0.5%碘伏消毒颈部皮肤，常规铺单。于甲状软骨水平，颈中线偏左2cm，向下行3cm长切口切开皮肤，分离出颈静脉，一次性采血20ml，迅速分盛于2支10ml玻璃离心管内，以3000r/min转速离心10min，之后缝合颈部切口。离心后可见试管内分为3层：最上层是无细胞血浆层，为半透明的淡黄色液体；下层为血细胞层，含有大量的红细胞；两者之间的半

9、透明浅黄色凝块即为富血小板纤维蛋白（PRF）。 1.2.2 制备上颌双侧牙槽嵴裂：头面部及口内消毒，铺单，利多卡因浸润麻醉术区。沿上唇系带自龈缘至前庭沟底切开至骨面，再沿双侧中切牙、双侧第一、二侧切牙龈缘至双侧尖牙近中侧切开粘膜至骨面，形成倒T形切口，翻起颊侧粘膜至鼻底部，显露骨组织。腭侧沿龈缘切开中切牙远中至尖牙近中粘膜至骨面，翻起粘膜瓣与颊侧暴露位置相对应。以骨钻磨切，生理盐水冲淋降温，先于尖牙近中处，沿牙体长轴方向制备一个裂隙，上至鼻底，深达鼻腭孔，方向与颅骨长轴方向垂直。再于第一侧切牙近中沿牙体长轴方向制备一个裂隙，深至腭侧骨壁，制备时偏远中，减少对中切牙牙根的损伤。之后在腭侧制备一裂

10、隙将前两个裂隙连通，方向平行于颅骨长轴。最后在确认鼻底粘膜完整的情况下，以咬骨钳连同骨段及第一、二侧切牙一同截下，得到近似矩形的骨缺损。另一侧以同样方法制备，即得到了双侧牙槽嵴裂骨缺损的模型。 1.2.3 取髂骨术：解开一侧固定的后肢，犬使下半身改为侧卧位。沿髂前上嵴外侧缘行长约4cm的切口切开皮肤，解剖暴露出髂前上嵴，以骨钻将髂前上嵴处骨质整块截下，大小约2cm×3cm，呈矩形。充分止血后，关闭切口。将取下的髂骨制备成直径23mm大小的碎骨块，等分成两份，待用。 1.2.4 牙槽嵴裂植骨：取出离心完成的玻璃离心管，将管口消毒，以止血钳将富血小板纤维蛋白层（PRF）连同下方的血细胞层

11、一起夹出，剪去下方的血细胞层分离，把PRF至于无菌干纱布上，以另一块纱布将其压成薄片，即得到PRF膜片，再将PRF膜片剪碎，制备成直径约1mm的PRF碎块，随机加入一份碎骨块，充分混合。将两份骨块按照实验计划分别填于两侧骨缺损，适当加压，充分填匀，保证粘膜瓣无张力的情况下严密缝合，关闭切口。 1.3 术后处理：术后实验动物进半流质饮食，术后连续3日肌注青霉素预防感染，每日观察口内切口并行颈部及髂部切口换药，10日后拆除颈部髂部缝线。分别于术后当日、2个月、4个月时拍摄上颌骨CT。杨雁等10在术后8周时发现宿主骨与移植骨完全融合，12周时骨吸收趋于稳定，考虑到实验动物的个体差异，故将CT拍摄时间

12、定为术后2个月与4个月。 1.4 影像学评价与测量：在以往的研究中，对于植骨效果的评估是采用拍摄二维平片的方法。二维平片存在的问题是投照角度无法固定导致图像放大畸变，另外二维影像学资料只能测量牙槽嵴高度这一单一指标，无法测量体积变化。随着CT及三维重建软件的发展，三维测量实现了可能。 1.4.1三维重建原理：三维重建的原理就是将连续的多张平面图像叠加起来，还原成三维图像。在临床病例中，由于牙槽嵴裂患者的骨缺损形状不规则，重建及测量体积十分复杂。所以在制造缺损时就要考虑测量的问题，本实验中截骨方向均垂直或平行于颅骨的长轴方向，水平位上看，植骨区的形状近似于一个梯形，冠状位上，每一层图像上的植骨部

13、位近似一个矩形。拍摄CT行冠状位扫描，再以冠状位的平面图像进行三维重建。 1.4.2 体积测量方法：本实验使用的是mimics10.01软件。术后当日，实验犬全麻拍摄第1次CT，此时的可以确定植入骨质的总量，术后2个月、4个月的CT反应这两个时间点骨生长情况。首先分别将这3个时间点的影像重建，利用mimics将其拟合，即重叠在一起，这时可以看到同一部位不同时间点的图像。在CT图像上，我们可以很轻易地区分完整骨段与碎骨块，这样就可以利用术后当日的图像定位出植骨的范围，利用软件选中每层图像上包含植骨区的区域，将它们叠加起来，即可以算出植骨区域的体积，比较不同时间点的植骨区体积，即可以算出植入骨质的

14、吸收情况。分别计算出每个时间点每只犬实验侧与对照侧的骨吸收率，进行配对t检验，检验是否有统计学差异。 2 结果 2.1 实验动物情况：所有实验动物均正常成活，术后未出现伤口感染，骨块排出等情况。 2.2 CT影像：术后当日CT显示，双侧骨缺损均完整充填，可清晰地分辨出移植骨与宿主骨，由于实验侧混有PFR碎块，实验侧骨质密度低于对照侧（如图1c）。术后2个月CT显示，移植骨与宿主骨已无明显界限，两侧均有骨质吸收的情况发生，对照侧骨质吸收的情况明显大于实验侧，边缘骨皮质结构已开始形成，但密度仍小于正常骨皮质密度（图1b）。术后4个月CT显示，双侧植骨区骨质吸收仍在继续，但程度已较术后2个月时明显减

15、少，骨皮质密度已与正常骨皮质接近，对照侧骨质吸收明显大于实验侧（图1c）。 2.3三维重建图像：三维重建图像上可以直观看出对照侧的骨吸收情况大于实验侧。骨的吸收主要发生在外侧缘，远离宿主骨的部位有更明显的吸收，呈向内凹陷的形态（如图2）。 2.4 体积测量：2个月时，实验侧吸收率（11.37±1.51）%、对照侧（21.89±3.54）%，使用SPSS13.0统计软件进行配对样本的t检验，P<0.01。4个月时，实验侧吸收率（16.16±2.03）%、对照侧（25.60±3.61）%，进行配对样本的t检验，P<0.01（如图3）。 3 讨论

16、3.1 PRF与骨生长：实验中笔者发现PRF的加入可以促进骨形成，在一定程度上减少骨吸收。PRF有一个重要的特性：可以持续的释放生长因子。Dohan ED等11的实验发现，PRF膜片在至少1周的时间内缓慢释放TGF-1、VEGF、PDGF等生长因子，随着PRF膜片的分解，包含在其中的细胞因子被逐步释放出来造成了PRF的缓释作用。这些生长因子的缓慢释放可以在术后的一段时间内有效的促进成骨细胞的增殖，生长更多的新骨，还可以促进血管的生成，使新骨更早的建立血供。孙洁等12通过对PRF的HE染色组织切片及扫描电镜和透射电镜的观察，证实了PRF的主要结构是纤维蛋白形成的疏松的三维立体网络结构，并发现这种

17、纤维蛋白网状结构与人类天然的组织结构非常相似，这种网状结构能诱导细胞迁移和细胞增殖，并有利于营养物质的弥散进入。在牙槽嵴裂植骨手术中，使用的是自体髂骨，其中包含有大量的骨髓间质干细胞。魏思维等13研究发现，富血小板纤维蛋白可以诱导骨髓间质干细胞分化为成骨细胞，且分化的类成骨细胞具有成骨细胞的特性。在本实验中笔者发现，两侧植骨区的骨吸收都发生在远离骨壁的部位，尤其是对照侧出现了明显的向内凹陷的形状。笔者推测，这种现象与血供的建立有关，与骨壁接近的部位可以更早的建立血供，植骨区远端的骨块难以在早期建立有效的血供，所以更容易吸收。与对照侧相比，实验侧并未出现明显的向内凹陷的骨吸收形态，边缘呈不整齐的

18、形态，隐约可见植入骨块的形态。可以推测，实验侧的血供建立早于对照侧，使得位于远端的骨块更容易成活。实验侧的骨块中混有PRF膜片，在膜片的分解过程中，包含在其中的生长因子被逐步释放出来，使得血管的形成能够更早发生，远端的骨块成活的更多，而对照侧的血供仍只能以正常的速度建立，于是便出现了实验侧与对照侧骨吸收差异。 3.2PRF与PRP：富血小板血浆（PRP）对于牙槽嵴裂植骨的作用已经被学者们所证实，然而其在制备使用的过程中仍然存在一些问题。它的制备过程仍没有一套统一的标准，并且在应用时需要加入外源性凝血酶，这就使得其在应用时需要考虑安全性的问题，与PRP相比，富血小板纤维蛋白（PRF）在制备时过程

19、中不需要加入凝血酶及抗凝剂，制备过程更加简单，制备所需材料仅为自体血，其安全性得到了保证4-6。正是因为具备了这样的特性，使得PRF更加具有临床应用的价值。 3.3 对临床的启示：本实验采用的是犬的即刻植骨模型，与临床患者的情况仍有一定差异，牙槽嵴裂的患者的植骨区骨壁为皮质骨，而实验动物的植骨区骨壁为新鲜的骨创面，血供充足。从实验结果来看，即使是对照侧的骨吸收率，也低于一些文献报道中的临床病人牙槽嵴植骨手术的骨吸收率，这提示我们，在临床手术时，刻意的制造植骨区骨壁的骨创面是否能够提高手术效果，值得我们进一步研究。 3.4 三维影像测量：自牙槽嵴裂手术开始之时，人们便在探索手术效果的评价方法，最

20、早只能拍摄二维的平片，于是出现了基于牙槽嵴高度、裂隙容纳骨量、植骨位置及骨量等多种测量方法，但这些方法均不能避免图像畸变、解剖结构重叠、不便于量化比较等缺点14。随着CT技术及计算机软件的发展，出现了三维影像重建技术，这一技术可以实现对组织结构的精确、直观的观察，更重要的是，这一技术可以实现对体积的测量。对于牙槽嵴裂植骨骨吸收的研究，体积的变化是十分可靠的评价标准。在本实验中，笔者为了便于体积测量，将骨缺损设计成了较为规则的形状，缺损各骨壁均与犬颅骨长轴平行或垂直，通过测量各个时间点的体积，计算出骨吸收的情况，这种方法可以作为一种研究牙槽嵴裂骨吸收率的实验方法。但由于牙槽嵴裂患者缺隙的形态十分

21、复杂，在临床上尚无一种公认的测量方法及标准，仍需学者们继续探索。 本实验证明，将PRF加入自体髂骨进行骨移植修复犬的牙槽嵴裂，在术后4个月的时间范围内，可以减少术后的骨吸收。但仍有一些问题尚不清楚，如PRF作用用于植骨手术的具体机制、PRF与骨块的比例等。这些问题仍需我们近一步研究。 参考文献 1Boyne PJ，Sands NR.Secondary bone grafting of residual alveolar and palatal cleftsJ.J Oral Surg，1972，30（2）：87-92. 2马莲.唇腭裂治疗之我见J.中华口腔医学杂志，2010，45（10）：577

22、- 580. 3Marukawa E，Oshina H，Iino G，et al.Reduction of bone resorption by the application of platelet-rich plasma （PRP） in bone grafting of the alveolar cleftJ.J Craniomaxillofac Surg，2011，39（4）：278-283. 4Dohan DM，Choukroun J，Diss A，et al.Platelet-rich fibrin （PRF）：a second-generation platelet concen

23、trate. Part I：technological concepts and evolutionJ.Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod，2006，101（3）：e37-e44. 5Dohan DM，Choukroun J，Diss A，et al.Platelet-rich fibrin （PRF）：a second-generation platelet concentrate. Part II：platelet-related biologic featuresJ.Oral Surg Oral Med Oral Pathol

24、 Oral Radiol Endod，2006，101（3）：e45-e50. 6Choukroun J，Diss A，Simonpieri A，et al.Platelet-rich fibrin （PRF）：a second-generation platelet concentrate.Part V：histologic evaluations of PRF effects on bone allograft maturation in sinus liftJ. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod，2006，101（3）：299-303. 7Sharma A，Pradeep AR.Autologous platelet-rich fibrin in the treatment of mandibular degree II furcation defects： a randomized clinical trialJ.J Periodontol，2011，82（10）：1396-1403. 8Lee JW，Kim SG，Kim JY，et al.Restoration of a peri-im