弓形虫IgG酶联免疫法检测试剂盒

1、弓形虫IgG酶联免疫法检测试剂盒（TOXO IgG ELISA TEST SYSTEM）体外诊断试剂 产品编号：8Z8651G简 介：宙斯（Zeus）公司的弓形虫 IgG 酶联免疫检测试剂盒是应用酶联免疫技术定性或定量检测人血清中的弓形虫IgG 抗体的系统。目的是为弓形虫的感染提供血清学证据，用于体外诊断。本产品FDA没有明确可以用于检测血液和献血者。背 景：刚地弓形虫是一类分布在世界范围内的细胞内原生动物寄生虫（1，2）。虽然猫科动物是其终宿主，但该生物体却能感染几乎所有的哺乳动物和鸟类。血清学数据表明虽然不同国家的人弓形虫盛行的种类不同，但大部分的工业化国家有大约30%的人都会慢慢受到该原

2、虫的感染（3）。弓形虫有三种存在形式：滋养体、包囊和卵囊（1，2）。滋养体（速殖子）在急性感染阶段是具有攻击性的形式。原虫在宿主细胞胞质中繁殖以后形成组织包囊形式，此时的包囊可以包含数千个生物体（缓殖子）。卵囊只在猫科动物的小肠上皮细胞中发育，并未在其他宿主中发现。卵囊随着猫科动物排泄的粪便排出体外，数天后发育成熟。人类或其他动物摄取了具有包囊的生的、未加工的肉或具有卵囊的被猫的粪便污染了的食物便得到感染。一旦消化，该寄生虫便从包囊中（缓殖子）被释放出来，卵囊（孢子体）被消化酶消化并侵染小肠粘膜。寄生虫就地繁殖然后以包囊的形式转移到其他器官，包囊可以在宿主的生命中长期存在。包囊主要存在于脑、心

3、脏和骨骼肌中。感染刚地弓形虫的人大多数（8090%）是无症状的（4）。感染急性弓形虫的成年人大多表现的临床症状为无症状的单结或多结淋巴结病症状，伴随淋巴结病症状还有发热、身体不适和非典型性淋巴细胞增多，症状与单核细胞增多症相同。少数宿主患者通常会出现严重的并发症，像脑炎、心肌炎或局部急性肺炎等（1）。尽管感染刚地弓形虫对于一般寄主通常并无疾病影响，但是，对于那些患有免疫缺陷疾病的寄主却是致命的（5）。免疫缺陷的病人可以发展成具有严重传染性的弓形虫病，或弓形虫性脑炎，或者同时患上这两种病。弓形虫在艾滋病患者体内通常会侵染患者的中枢神经系统（6）。血清学证据表明，弓形虫性脑炎是艾滋病患者身上的潜在

4、传染病，大约30%的弓形虫抗体阳性的艾滋病患者将会发展成弓形虫性脑炎（7）。当一名血清学检测阴性的妇女在怀孕期间感染了弓形虫，该生物体便通过胎盘传送给胎儿（1，8）。胎儿感染的严重性根据感染的时期不同而有所不同，前期感染的可以导致孕妇自然性流产，或者顺利生产但新生儿有明显的疾病症状。如果在怀孕后期感染，新生儿通常会没有症状，所以不易识别（8）。先天性感染弓形虫病的新生婴儿大约有75%是无症状的。然而，几乎所有具有潜在弓形虫病的儿童在他以后的成长过程中其视力或神经系统发育均会留下后遗症。大约8085%的儿童发育成视网膜炎，甚至一些儿童会失明或者患上精神性运动或智力障碍。目前，有很多种检测刚地弓形

5、虫抗体的血清学方法作为辅助诊断急性传染或评价先前感染弓形虫的方法。常用的方法包括：Sabin-Feldman 染色法、直接凝集法、间接凝集法、乳胶凝集法、间接免疫荧光法和ELISA法（9）。ELISA法检测原理：宙斯公司的TOXO IgG ELISA 试剂盒用来检测人血清中的IgG抗体。通过与抗原的被动吸收使检测变得更灵敏。整个检测步骤包括三步温育过程。1 待测血清经过适当稀释后，在包被有抗原的微孔板上温育。样本中特异性抗体将与免疫抗原结合。然后洗去未结合的抗体和血清中其他的成分。2 结合有过氧化物酶的羊抗人IgG（g链），加到微孔板上温育。结合物与第一步中事先连接在板上的抗体杂交。然后洗去未

6、反应的结合物。3 固定在微孔板上的免疫过氧化物酶结合物与其底物溶液反应，底物水解发生颜色变化。一定时间后终止反应，读取光吸收值即可。溶液颜色的深浅与原始待测样本中的抗体浓度有关。试剂盒提供成份每个试剂盒内包含有足够数量的下列组份，以便于能进行包装所示的试验次数。1 酶标板。96孔12条8孔板，用灭活弓形虫（RH链）抗原包被的酶标板，酶标板放置在酶标板框架上并密封在一个含有干燥剂的包装袋中。2 结合剂。辣根过氧化物酶结合的抗人IgG（g链）。直接使用，15ml，一瓶，白色盖子。内加防腐剂。3 ml一支，红色盖子。内加防腐剂。4 ml一支，蓝色盖子。内加防腐剂。5 ml一支，绿色盖子。内加防腐剂。

7、6 样品稀释液。30ml，一瓶（绿色盖子）。溶液中含有Tween-20、BSA、磷酸盐缓冲液（0.2）和抗人IgG(链)，。紫色溶液，直接使用。注：使用前充分混匀。（产品编号：005N）。内加防腐剂。7 TMB。15ml一瓶，琥珀色瓶子（琥珀色盖子），含有TMB，直接使用。溶液中含DMSO15%（W）。8 终止液。15ml一瓶，红色盖子，溶液中含有1 M H2SO4，0.7M HCl。直接使用。9 浓缩洗板液（10浓度）：1份浓缩洗板液加9份的去离子水或蒸馏水。100ml一瓶(透明盖子)，含有10浓度磷酸盐缓冲液（0.2）、Tween-20（蓝色溶液）。内加防腐剂。（注：1浓度的溶液PH应为。

8、）以下溶液不是每批都有差别的，可以通用于ELISA试剂盒：TMB、终止液、洗板液。注：试剂盒内同样包括有：1 各组分清单和不同批号特异的资料。2 使用说明书预先警告：1 用于体外诊断。2 接触实验室试剂时常规的注意事项。如果接触到眼睛，立即用大量的水冲洗并到医院检查。穿适当的防护服，戴手套和眼/脸保护设备。不要呼吸到蒸汽。处理废弃物时遵守相关法规。3 ELISA板上没有活性的有机物。但应将之视为有潜在生物毒性的物质并小心处理。4人血清对照品是有潜在生物毒性的物质。产品的原材料经检测对HIV-1抗原和HBsAg以及抗HCV、抗HIV抗体是阴性的。但没有实验方法可以完全确保无感染因素，因此，这些样

9、品还是应该按照生物安全标准2进行处理。根据疾病控制中心和国家健康控制研究院手册“微生物和生物医学实验室的生物安全”现版本和对血液病原体处理的OSHAs标准推荐的方法，处理任何具有潜在传染性的人血清或血液制品。5 严格按照说明书中指定的温育时间和温度操作是获得正确结果的重要保证。实验前一定要使所有试剂的温度回复至室温（2025）。没有用完的试剂应立即放回到冰箱。6 不正确的清洗会导致假阳性或假阴性的结果。加入结合试剂和底物溶液之前一定要确保尽量拍干的残留的洗板液。另外，在温育过程中要避免微孔干透。7 人血清对照、样本稀释液、结合物和浓缩洗板液都包含有防腐剂（thimerosal,0.04%(w/

10、v)），一旦误服将引起中毒。8 终止液有毒，如果吸入、接触到皮肤或误服将烧坏。如果发生此类情况立即就医。9 TMB溶液将刺激眼睛、呼吸系统和皮肤。10. 浓缩的洗板液将刺激眼睛、呼吸系统和皮肤。11. 擦掉微孔板底部残留的试剂和手印以免影响OD读数。12. 稀释或掺杂其他试剂会导致错误的结果。13. 不要用其他批号的试剂或其他厂家的产品来替代试剂盒中的试剂。14. TMB溶液应该是无色的。当使用时，显示很浅的黄色、绿色或兰色。它与结合物或其他氧化物的污染会导致溶液过早地改变颜色。如果底物溶液已经变成明显的蓝色时切勿使用。15. 切勿用嘴吸移液管。避免试剂和病人样品与皮肤或粘膜接触。16. 避免

11、试剂被微生物污染，这将产生错误的结果。17. 试剂和样本的交叉污染会导致错误的结果。18. 重复使用的玻璃容器应清洗，并彻底冲去洗涤剂。19. 避免溶液飞溅或产生气溶胶。20. 在储存和温育过程中，避免把试剂暴露在强光下。21. 先将微孔板回复至室温，然后再打开袋子，这样可以避免孔中成分的凝结。22. 洗板液应该收集在处理盘中，用10%的家用漂白剂（0.5%次氯酸钠）进行消毒。23. 注意：酸性pH的废液在加漂白剂处理前必须先中和。24. 如果干燥剂上的指示条已经从兰色变成粉红色，不要再使用ELISA板了。25. 不要让结合剂接触到含有叠氮钠的溶液，微量的叠氮钠就会影响结合剂的酶活力。26.

12、不要让任何反应试剂接触到含有漂白剂的溶液。微量的漂白剂（次氯酸钠）会影响试剂盒内很多试剂的生物活性。自备设备和材料：1 能在450nm读数的酶标仪2 能精确吸取10到200ul的移液器3 多通道移液器，能精确吸取50-200 ul4 适用于多通道移液器的贮液槽5 洗瓶或洗板机6 蒸馏水或去离子水7 1L量筒8 专用于吸血清的移液器9 一次性吸头10. 纸巾11. 实验室用的计时器以便控制温育时间12. 装有消毒剂的废液缸（例：10%的家用漂白剂、0.5%的次氯酸钠）保存条件：1 未开封的试剂盒：保存在2-8C。2 微孔板条：保存在2-8C。已开封未用完的微孔板应立即放入原有密封袋中，保存在2-

13、8C。只要干燥剂上的指示条仍为兰色，密封袋开封后，板条可稳定60天。3 结合剂：保存在2-8C。不得冻存。4 校正品、阳性和阴性对照：保存在2-8C。5 TMB：保存在2-8C。6 浓缩的洗板液（10）：保存在2-25C。稀释到1浓度后在室温（20-25C）可稳定7天，或在2-8C可稳定30天。7 样本稀释液：保存在2-8C。8 终止液：保存在2-25C。标本采集：1. 建议根据NCCLS的M29号文件来采集标本（接触有传染性疾病的实验室工作者的防护）。2. 没有已知的试验方法可以完全证明人的血液标本不会导致感染，因此，所有的血液都应视为有潜在的传染性。3 本试验选用的标本为无菌静脉穿刺取得的

14、血液，经新鲜沉降和冷藏获得的血清。不得使用抗凝剂和防腐剂。避免使用溶血、脂血和细菌污染的血清。4 标本在室温保存不得超过8小时。如果8小时内不进行检测，应把血清保存在2-8C最多48小时。如时间更久，应把标本放在-20C或更低。不要反复冻融标本以免造成抗体活力降低并影响最终结果。操作步骤：1 将试剂盒组分从贮存条件取出，使其恢复至室温（20-25）。2 确定试验所需微孔板数量。每次试验都应设六个质控品/校正品（一个试剂空白对照、一个阴性对照、三个校正品和一个阳性对照）。每次试验均需设置试剂空白对照。检查软件和酶标仪以确认质控品/校正品的参数。将剩余的板条仍然放入有干燥剂的密封袋中，保存在2-8

15、。样本排列12A空白对照标本3B阴性对照标本4C校正品等等D校正品E校正品F阳性对照G标本1H标本23 按1：21倍数稀释阳性对照、校正品、阴性对照和每个病人的血清样品（例如：10ml血清+200ml样本稀释液，使用前充分混匀）。4 在每个孔内加入100ml稀释过的对照、校正品和样本。保证标本充分混匀。不同的样本使用不同的吸头。5 加入100ml样本稀释液于A1作为试剂空白对照。检查软件和酶标仪以确认试剂空白的参数。6 板条在室温（20-25C）温育255分钟。7 洗板5次。A 手工洗板步骤：a 甩掉孔中的液体。b 在每个孔内加入洗板液，确保孔中无气泡。c 重复a和b步骤，洗板5次。d 甩掉孔

16、中的洗板液，在纸巾上拍干孔中的洗板液。目测微孔中无残留洗板液。把洗板液收集在废液缸中，并在每天实验结束用%次氯酸钠处理。B 自动洗板步骤：如果使用自动洗板机，把洗板溶液体积设置为300-350ml/孔。设置无间隔循环清洗五次。最后将微孔板从洗板机上取下，置于纸巾上拍干。8 每孔中加入100ml结合剂，按照样品加入的顺序以相同的速率和顺序依次加入微孔板中。9 微孔板在室温（20-25C）温育255分钟。10. 按照步骤7进行洗板。11. 每孔中加入100ml TMB，按照样品加入的顺序以相同的速率和顺序依次加入微孔板中。12. 微孔板在室温（20-25C）温育10-15分钟。13. 每孔加入50

17、ml终止液以终止反应，按照TMB底物溶液加入的顺序以相同的速率和顺序依次加入微孔板中。阳性的标本会从兰色变为黄色。加入终止液后，拍打平板数次以确保样品完全混合。14. 将微孔板置于450nm波长下读取每个孔的光密度值，以空白试剂作对照。应在加入终止液30分钟内读取数据。质量控制：1 每次试验中，校正品都要重复3次。同时包括一个试剂空白对照、阴性对照、阳性对照。2 计算3个校正品的平均值。如果有一个值超过平均值的15%，则剔除后计算另两个孔的平均值。3 校正品的平均OD值和阳性对照、阴性对照的值应在以下范围：OD值范围阴性对照校正品阳性对照A. 阴性对照的OD值除以校正品的平均OD值应B. 阳性

18、对照的OD值除以校正品的平均OD值应C. 如果不符合上述要求，认为本次试验无效应重复试验。4 阳性对照和阴性对照用来监控试剂的情况，并不能保证Cutoff值的准确性。5 根据要求还可以加入其他对照。6 本质量控制参照NCCLS的C24号文件：定性测试的统计学质量控制。结果判断：A 计算：1 校正因子阳性标本的cutoff值由生产者确定，并与校正品有关。校正因子（CF）可以帮助你判断阳性标本的域值，纠正每次实验中细微的读数变化。校正因子的确定应决定于不同批的试剂盒的不同组分，并打印在试剂盒的组分表中。2 Cutoff值用校正因子乘以校正品的平均值即获得Cutoff值。3参考值或OD比率每个标本都

19、要计算参考值或OD比率，方法是它们的OD值除以步骤2中得来的cutoff值。例如：校正品的平均OD值校正因子（CF）Cutoff值未知标本的OD值标本的参考值或OD比率说明：参考值或OD比率按如下判断：参考值或OD比率阴性样本可疑样本阳性样本1 OD比率0.90表明没有检测到弓形虫抗体。阴性结果表明近期或以前未感染过弓形虫。这样的个体怀疑为首次感染者，首次感染如果标本采集时间过早，则可能检测不到IgG抗体。如果怀疑该患者为早期感染者，应该在8-14天内再次采集该个体的标本，并将新采集的标本与前面的标本同时重复试验以确定是否血清转化。2OD比率IgG抗体阳性。该结果表明该个体为感染或近期感染弓形

20、虫。3 样本的OD比率如果在以下范围内（0.91-1.09），应该重复试验。如果重复实验的结果仍然是可疑的，则应用另一种血清学方法测定如宙斯公司的IFA试剂盒。4 为评价成对的（急性和预后的）血清，要同时对两个样本检测。如果急性的标本是阴性的而预后的是阳性的，则发生了血清转化，预示着首次弓形虫感染。COD比到IU/ml的转换：OD比转换到IU/ml可以通过用OD比乘以20来计算，可按如下判断。IU/ml阴性样本 18阳性样本 22可疑样本对标本阳性、阴性和可疑的解释可参见“”项中。注：本试验结果是线性的，和WHO 0-35的标准有较好的相关性。如果标本测得的值 35 IU/ml，则报为“阳性”

21、或“35 IU/ml”。如果需要更精确，那么就需要把标本稀释后再做一次检测。最终结果可以用稀释倍数乘以IU/ml的值。例如： 初始结果 OD比 = 2.86 = 57.3 IU/ml 标本稀释1：4后，再按说明书中1：21的稀释后同法检测。 再次检测结果 OD比 = 1.46 = 29.3 IU/ml 4 = 117.3 IU/ml方法的限制性：单一血清样本的抗体滴度并不能说明近期是否感染。而应该采集急性和预后的样本同时检测以确定是否发生血清转化。1 试验结果应结合临床评价和其他诊断方法结果进行综合判断。2 标本采集如果时间过早，可能会导致检测不到IgG抗体。在这种情况下，则需在2-7周后再取

22、一次样本，与第一次的样本一同进行检验看是否有血清转化。或者检测IgM抗体如使用宙斯公司的弓形虫IgM ELISA 诊断试剂盒。3 未足月的婴儿如检测出弓形虫 IgG，在判断时应该要谨慎，因为通过母体被动获得的抗体可能会持续6个月。如是阴性结果则排除了先天性感染的可能（12）。4 本实验结果是定性的，应该考虑弓形虫IgG抗体可能为阳性也可能为阴性。期望值：根据年龄和地域差别，在美国成年人中大约20-70%会检测出弓形虫抗体（2）。性能特征值：A比较研究：宙斯公司生产的弓形虫IgG ELISA检测系统与市售其他公司的用ELISA方法检测弓形虫IgG抗体的产品进行比较。共201份血清标本做了检测，结

23、果如下：对照的弓形虫 IgG ELISA宙斯弓形虫IgG ELISA阳性阴性阳性456阴性3147灵敏度 = 93.8% （45/48）特异性 = 96.1% （147/153）B用宙斯试剂盒对WHO标准的评价实验结果如下：结 果标准（IU/ml）OD比IU/ml说 明500416*阳性250208*阳性125112*阳性6252*阳性3126阳性16可疑8阴性4阴性2阴性*标本浓度 35 IU/ml，需要另外稀释以确定值。C. 重复性:为了评估intra-assay和 inter-assay，宙斯弓形虫IgG ELISA测试系统对4个强阳性、弱阳性、阴性样本的OD比范围进行检测。将每个样本重

24、复8份，在3个连续工作日中进行检测。计算每个样本的平均OD比和变异系数（CV）。数据显示如下：Intra-Assay（N=8）Inter-assay（N=3）血清样本一次检测 二次检测 三次检测平均比CV平均比CV平均比CV平均比CV14.0%4.8%4.1%1.8%25.7%36.5%13.2%7.5%8.2%412.0%10.2%8.3%5.1%简明步骤：1. 稀释血清1：212. 每孔加稀释过的血清100ml3. 温育20-30分钟4. 洗板5. 每孔加结合剂100ml6. 温育20-30分钟7. 洗板8. 每孔加TMB 100ml9. 温育10-15分钟10. 每孔加终止液50ml11

25、. 读数参考文献1. Krick JA and Remington JS: Toxoplasmosis in the adult-an overview. New Eng. J Med. 298:550-553, 1978.2. Anderson SE and Remington JS: The diagnosis of toxoplasmosis. So. Med. J. 68:1433-1443, 1975.3. Fdeman HA: Toxoplasmosis: An overview. Bull. N. Y. Acad. Med. 50:110-127, 1974.4. Wekch P

26、C, MasurH, Jones TC and Remington JS: Serologic diagnosis of acute lymphadenopathic toxoplasmosis. J. Infect. Dis. 42:256-264, 1980.5. Ruskin J and Remington JS: Toxoplasmosis in the compromised host. Ann. Intern. Med. 84:193-199, 1976.6. Luff BJ and Remington JS:Toxoplasmosis encephalitis. J. Infect. Dis. 157:1-6, 1988.7. McCabe Rand Reminggton JS: Toxoplasmosis: The time has come. New Eng. J. Med. 318:131-135, 1988.8. Wilson CB, Remington JS, Stagno S and Reynolds DW: Development of adverse seqelae in children born with subclinical congenital Toxoplasma in