2019年整理真菌DNA大量提取

1、核裂解法大量提取真菌 DNA、试剂的配制1.2.EDTA-Na2 (0.1 M):称取 3.72 g Na2EDTA 2H2O,用超纯水定容至 100 mL。Tris-HCl (1 M , pH):称取 12.11 g Tris-HCl，用 90-95 mL 超纯水溶解，调3.pH至8.0后，在定容至100 mL。核裂解液（10 mM Tris-HCl,400 mM NaCl ，2 mM EDTA-Na2，0.8 mM 盐酸胍）：分别称取76.43 g盐酸胍，23.38 g NaCl于1 L烧杯中，加入灭菌超纯水充分搅拌溶解至 900 mL,再加入 10 mL 1 M Tris-HCl 和 2

2、0 mL0.1 M EDTA-Na2,4.搅拌溶解，调pH至8.0,定容至1000 mL,高温灭菌，冷却待用。SDS （20%）:称取20 g SDS,灭菌超纯水定容至 100 mL。（ SDS不能采用高温高压灭菌）5.盐酸胍：强烈变性剂，可溶解蛋白质，导致 细胞结构 破坏，核蛋白二级结构 破坏，从核酸上解离下来，此外， RNA 酶可被盐酸胍等还原剂灭活。1.、操作步骤称取液体培养基PPDA培养样品1.0-1.5 g （可用灭菌超纯水或TE缓冲液清洗 1-2 次），研钵先用液氮预冷， 再将样品用液氮研磨， 直至全部研磨成均匀2.粉末。转入预装5 mL（与样品质量比为1:4-1:6 ）核裂解液的

3、15 ml离心管中，加入60 pl 50 mg/mL 蛋白酶 K (80-150 d，20 mg/mL)，10 JRNase A 充分震荡15s 混匀。3.加入500 d 20% SDS （终浓度1%-5%），震荡混匀。4.56-65C水浴，约3 h,至出现较多上清，期间不断颠倒混匀。冷却后，4°C, 6000 rpm,离心10 min，吸取上清至另一新的15 mL离心管 中。加入10 d &巯基乙醇（终浓度 0.02%）,再加入等体积的酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）,颠倒混匀30次左右，6000 rpm,离心10 min。（该步骤须在通风厨中进行，颠倒混匀动作轻柔，避免

4、剧烈震荡）7.8.9.吸取上清至另一新的 15 mL 离心管，注意不要吸到中间蛋白层。如果上清十分浑浊，可用等体积氯仿 /异戊醇（ 24:1）再抽提一到两次，同样 6000 rpm离心10 min,将上清转至新的离心管。（该步骤须在通风厨中进行, 颠倒混匀动作轻柔,避免剧烈震荡） 加入等体积-20C预冷的异丙醇（可先加入 1/10体积3 M , PH5.2的NaAc, 沉淀效果更好），轻柔颠倒混匀，如果 DNA 沉淀呈絮团状，可用移液枪枪头或干净玻璃棒将 DNA 絮状沉淀挑出，若 DNA 不呈完整絮状沉淀或沉淀较少， 可在-20 C冰箱放置1-2 h促沉淀。10.若DNA沉淀无法直接挑出，可4

5、C, 6000 rpm，10 min收集沉淀，弃尽上清, 挑出 DNA 沉淀。11. 将 DNA 沉淀转入 2 mL EP 管,加入 1 mL 预冷的 70%乙醇,轻弹管壁重悬 沉淀。混匀洗涤2-3次，以去除残余的盐，12000 rpm，2 min弃尽上清。12.加入1mL预冷的无水乙醇，轻弹管壁重悬沉淀；12000 rpm，离心2 min。（动作轻柔，不可剧烈震荡，避免造成 DNA 断裂）13. 室温放置 10-15 min 左右，使乙醇完全挥发，加入适当体积的灭菌超纯水或TE 缓冲液溶解。CTAB 法大量提取真菌基因组 DNA、试剂的配制1.CTAB （十六烷基三甲基溴化铵） 提取液（PH

6、 8.0）: 2% CTAB （w/v） ,1.4 MNacl， 0.02 M EDTA， 0.1 M Tris-cl， 0.2%巯基乙醇。即称取 CTAB 2 g 加蒸馏水 40 ml,力卩 1M Tris-cl(PH8.0) 10 ml, 0.5 M EDTA(PH 8.0)4 ml 和 5 MNaCl 28 ml （约8.19 g NaCl），于65E下溶解，用蒸馏水定容到 100 ml，最 后pH值8.0,灭菌后加入0.2 ml 3巯基乙醇。2.1 M Tris-cl ( PH 8.0): 12.11 g Tris碱；ddH2O, 80 ml; HCl，4.9 ml 三者混匀 充分溶解

7、后，滴加浓盐酸调 PH至8.0,定容至100 ml。3.4.5.6.0.5 M EDTA (PH 8.0):在 80ml 水中加入 18.01 g EDTANa2 - 2H2O 搅拌溶 解，用NaOH调PH至8.0 (约2 g NaOH颗粒),定容至100 ml。5 M NaCl 100ml :称取 29.22 g NaCl，用 ddH2O 定容到 100 ml。3 M NaAc 10ml :称取 2.46 g NaAc,用 ddH2O 定容到 10 ml, pH5.2。TE 溶液：Tris-HCl (pH=8.0, 1 mol/ L ) 5 ml, EDTA (pH=8.0, 0.5 mol

8、/ L)1 ml，力卩 ddH2O 定容至U 500 ml, PH8.0。、操作步骤1.称取液体培养基PPDA培养样品1.0 g,研钵先用液氮预冷，再将样品用液氮 研磨均匀，直至全部研磨至粉末，转入 15 ml离心管中，加入4 mL（与样品 质量比为1:4-1:6 ）65E预热的CTAB溶液（用前加入0.2%的伕巯基乙醇）， 充分振荡混匀。2.3.65C水浴，约45 min-60 min，期间颠倒混匀3-4次。冷却后，加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25:24:1），颠倒混匀 30次左右， 12000rpm，离心15 min。（该步骤须在通风厨中进行，颠倒混匀动作轻柔，避免剧4.烈震荡）吸取上清

9、至另一新的 15 mL 离心管，注意不要洗到中间蛋白层。5.加入等体积氯仿：异戊醇（24:1），12000 rpm，离心15-20 min，若上清仍十分浑浊，可重复2-3次。（该步骤须在通风厨中进行，颠倒混匀动作轻柔，避免剧烈震荡）6.7.吸取上清，转入新的离心管中，加入 1/10体积的 NaAc（3 M， pH5.2）o 加入等体积-20r预冷的异丙醇或两倍体积的无水乙醇颠倒混匀后置于-20C冰箱放置1-2 ho （颠倒混匀动作轻柔，不可剧烈震荡，避免造成DNA断裂）8.12000 rpm， 10 min 弃上清。9.向离心管中加入 70%的乙醇至管中 2/3 体积，混匀洗涤 2-3 次，以

10、去除残余 的盐，12000 rpm, 2 min弃尽上清。10. 室温放置 10-15 min 左右，使乙醇完全挥发，加入适当体积 ddH2O 或 TE 缓 冲液溶解，同时加入2-10 ulNA酶A，混匀，37C水浴30-60 min。准备 药品：Tirs 碱、浓盐酸、EDTANa2 2H2O、NaOH、NaCl、CTAB、酚、氯仿、异戊醇、无水乙醇、NaAc、液氮、巯基乙醇 研钵、恒温水浴、离心机、离心管 三、基本原理样品在液氮中研磨可以迅速破坏其细胞壁， 游离出细胞器和原生质， 并防止DNA降解。采用CTAB （十六烷基三甲基溴化胺，一种非离子型去污剂）抽提 液抽提（65C）上述研磨物。在

11、低离子强度溶液中 CTAB具有沉淀核酸与酸性多聚糖的特性，在高离子强度的溶液中 （0.7mol/L NaCl）,CTAB 溶解细胞膜相物 质，与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸。通过有机溶剂抽提，去 除蛋白、多糖、酚类等杂质后经过多次乙醇漂洗和沉淀，用RNase水解RNA，TE 缓冲液或已灭菌超纯水溶解得到较为纯净的 DNA 粗提物Tris-HCl （pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；NaCl提供一个高盐环境，使 DNA充分溶解，存在于液相中；伕巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚 容易去除基因组

12、 DNAo蛋白质的去除：酚/氯仿抽提使用变性剂变性（SDS、异硫氰酸胍等）高盐洗涤 蛋白酶处理核酸分离，纯化；多糖的去除：高盐法，用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入 1/2体积的 5MNaCl，高盐可溶解多糖。用多糖水解酶将多糖降解。在提取缓冲液中加一定量 的氯苯（1/2体积），氯苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖。用PEG8000代替乙醇沉淀DNA :在500卩L DNA液中加入200卩I 20% PEG8000含1.2 M NaCI）, 冰浴 20min. 核酸分离，纯化；多酚的去除：在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：3-巯基乙醇、抗坏血酸、 半胱氨酸、二硫苏糖醇等加入易与酚类结合的试剂：

13、如PVP（聚乙烯吡咯酮）,PEG（聚乙二醇），它们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与 DNA的结合;盐离子的去除： 70%的乙醇洗涤核酸吸附，沉淀和溶解使用合适的吸附材料吸附核酸，其它的杂质均被洗掉，达到纯化 DNA 的目的另一种方式加入 1/10体积的 NaAc（pH5.2,3M） ，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀 RNA 吸附或沉淀后应用70%的乙醇洗涤，以除去盐离子等若长期储存建议使用TE 缓冲液溶解 TE 中的EDTA能螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase, pH值为8.0,可防止DNA发生 酸解。DNA 中含有蛋白、多糖、多酚类杂质。 DNA 在溶解前，有酒精残留，酒精 抑制后续酶解

14、反应， DNA 中残留有金属离子，有 RNA 的存留。对策：重新纯化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等杂质，重新沉淀 DNA，让酒精充分挥发，增加 70%乙醇洗涤的次数（2-3次），加入RNase降解RNA。四、 DNA 质量检测1.取2-5卩l DNA力卩1卩l 6上样缓冲液混匀，以AHindlll DNA marker作为分子量标准，在1XrAE缓冲液中于120 V进行琼脂糖凝胶电泳20-30 m i n ，于紫外成像仪中拍照，检查 DNA 的质量；2. 取待测DNA样品10卩至一洁净的离心管中，加蒸馏水稀释至2 mL，转入到洁净的石英比色皿中，以等体积蒸馏水作为空白对照，于快速核酸 蛋白分析

15、仪或分光光度计上测定 OD260及OD280,根据OD260计算DNA的浓度，并以OD260/OD280的大小确定DNA的质量;五、常见问题1. 用酚抽提细胞 DNA 时，有什么作用？有什么优点？苯酚：使蛋白质变性，同时抑制了 DNase的降解作用。用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白与 DNA 联结键已断 ,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而 DNA 溶于水相。使用酚的优点：有效变性蛋白质；抑制了DNase的降解作用。缺点：能溶解10-15%的水，从而溶解一部分Poly（A）RNA。不能完全抑制 RNase的活 性。2. 氯仿的作用？ 氯仿：克服酚的缺点；加速有机相与

16、液相分层。最后用氯仿异丙醇抽提：去除核酸溶液中的迹量酚。 （酚易溶于氯仿中）3. 用酚 -氯仿抽提细胞基因组 DNA 时，通常要在酚 -氯仿中加少许异戊醇，为什么？ 异戊醇：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。 异戊醇可以降低表面张力， 从 而减少气泡产生。另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含 DNA 的水相、 中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。4. 用乙醇沉淀 DNA 时，为什么加入单价的阳离子？用乙醇沉淀 DNA 时，通常要在溶液中加入单价的阳离子，如 NaCl 或 NaAc，Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，而易于 聚集沉淀。DNA5. DN

17、A样品不纯，抑制后续酶解和 PCR反应。DNA提取常见问题：材料不新鲜或反复冻融、未很好抑制内源核酸酶的活性、提取过程操作过于剧烈， 被机械打断，外源核酸酶污染反复冻融。 尽量取新鲜材料， 低温保存材料避免反 复冻融，液氮研磨或匀浆组织后， 应在解冻前加入裂解缓冲液。 在提取内源核酸 酶含量丰富的材料的 DNA 时，可增加裂解液中螯合剂的含量，细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔。所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌。将 DNA 分装保 存于缓冲液中 ,避免反复冻融。6. DNA 降解， DNA 提取常见问题。实验材料不佳或量少，破壁或裂解不充分， 吸附或沉淀不完全，洗涤时 DNA 丢失。尽量选用新

18、鲜 （幼嫩 ）的材料，动植物要 匀浆研磨充分；G+菌，酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁。高温裂解时， 时间适当延长 （对于动物细胞 ,细菌可增加 PK 的用量）。增加吸附的时间、或低温 沉淀小心操作。7.1)2)3)4)5)6)7)要用冰冻材料提出高质量的基因组 DNA ，应确保以下几点： 确保采样后立即投入液氮中保存。在磨样时一定要一直使材料处于低温状态。研磨前先将液氮倒入研钵，研钵 彻底冷却后， 再放入材料， 研磨过程中， 一定不要让液氮挥发净使材料回温！ 否则会 DNA 降解得很厉害。装管的时候，材料一定要有液氮的保护才行！ 否则研磨时的液氮保护 DNA 不都前功尽弃了？ 可以这样做：将几个离心管放入一个容器， 向容器中加液氮， 将其冷冻一下， 使之处于低温状态， 将液氮还未挥发干净的材料放入管内， 不要急着盖盖子， 因为液氮不挥发干净就盖上会再次弹开。将离心管放入盛有液氮的容器，等 管内的液氮挥发干净盖上盖子即可。另外，如果是在离心