哮喘大鼠气道平滑肌细胞培养方法探讨

1、哮喘大鼠气道平滑肌细胞培养方法探讨 作者：卢虹蓓，张维溪，李昌崇【摘要】 目的：探讨哮喘大鼠气道平滑肌细胞培养方法，了解其生长特性。方法：制作慢性哮喘大鼠模型，用酶解离法、组织贴块法分别培养哮喘大鼠气道平滑肌细胞，倒置相差显微镜观察其生长情况，用免疫组化SP法分析SM-action抗原的表达。结果：以酶解离法培养23 d可见细胞贴壁，79 d可融合；以贴块法培养710 d组织块周围有细胞长出，1014 d融合，传代后细胞“谷峰”生长明显。SM-action免疫组化SP法染色均呈阳性。结论：两种方法均能培养出纯度较高的哮喘大鼠平滑肌细胞，其中酶解离法细胞产量高，纯度高，生长速度快，能为气道疾病细

2、胞实验提供可靠的细胞模型。 【关键词】 大鼠 哮喘 气道 平滑肌 细胞培养支气管哮喘(简称哮喘）是儿童最常见的一种慢性炎症性疾病， 气道重塑是引起慢性哮喘患者气道不可逆或部分不可逆阻塞的病理基础1，是诱发气道高反应性和哮喘慢性化的主要原因。平滑肌增生肥大是气道重塑的病理学特点之一2，故体外气道平滑肌细胞(airway smooth muscle cells，ASMC)培养是研究哮喘发病机制的重要手段。ASMC培养常用的培养方法有贴块法和酶解离法3-4。本研究用以上两种方法培养哮喘大鼠气道平滑肌细胞，观察其生长特点，并进行比较。1 材料和方法1.1 实验动物和试剂 46周龄雄性SD大鼠， 购自上

3、海动物中心。DMEM高糖培养基、0.25%胰蛋白酶/0.02% EDTA溶液、特级胎牛血清购自法国Biowest公司；D-Hanks液、青链霉素购自杭州吉诺生物医药技术有限公司；I型胶原酶、木瓜蛋白酶、牛血清白蛋白（BSA)购自美国Biosharp公司；大鼠抗-actin单克隆抗体购自武汉博士德公司；SP免疫组化试剂盒(二抗)购自上海晶美生物工程有限公司 。1.2 慢性哮喘大鼠气道重塑模型的建立 参考李昌崇等5-6的方法复制哮喘慢性模型，致敏阶段：第1天和第8天腹腔注射OVA/Al(OH)3混合液1.5 mL内含OVA 1 mg和Al(OH)3 100 mg；激发阶段：第15天开始以1% OV

4、A生理盐水溶液雾化吸入，隔天一次，每次30 min，共60 d。1.3 细胞培养1.3.1 ASMC原代培养：组织提取步骤为：以10%水合氯醛（400 mg/kg）腹腔注射处死大鼠，以75%酒精消毒表皮，从腹部至颈部依次剪开皮肤、肌肉，腹主动脉放血后剪开胸腔，自颈部至下迅速分离气管及肺部组织，剪去心脏， 置入含100 U/mL青链霉素的4 D-Hanks液中，转入超净台，依次去除肺组织、支气管动静脉、脂肪和残存结缔组织，仅剩余气管、支气管。纵向剖开气管、支气管，用外科刀片小心刮除外膜及内膜至组织呈透明状态，用眼科虹膜剪将气管段剪成1 mm或更小的组织块。组织贴块法：将剪好组织块用牙科探针贴于5

5、0 mL培养瓶底面（或者直接种于直径6 cm培养皿），等距排列，间隔0.51 mm，将培养瓶倒置，加入含20%胎牛血清的DMEM(高糖)培养基2 mL，不使培养液接触组织块。盖紧瓶口后静置约使组织块接近干涸（约3 h），轻轻翻转培养瓶，使培养液刚好没过组织块表面，拧松瓶口静置培养3 d后将培养液添至5 mL，第6天全换液，此后每3天换液一次。酶解离法（胶原酶-胰酶混合消化法）：将剪好组织块装入15 mL离心管中，加入配制好的I型胶原酶溶液2 mL（用D-Hanks液配制成含I型胶原酶2 mg/mL、木瓜蛋白酶2.5 mg/mL、牛血清白蛋白2.5 mg/mL的溶液），玻璃滴管轻轻吹打混匀，置入

6、37 ，5% CO2孵箱中消化25 min，取出后用含胎牛血清的DMEM(高糖)培养基终止消化，1 000 r/min离心5 min，弃去上清液，再加0.25%胰蛋白酶/0.02% EDTA溶液2 mL，以同样方法消化15 min，离心去上清，加入20%胎牛血清的DMEM(高糖)培养基约1.5 mL，半开放式培养，3 d后换液。1.3.2 ASMC传代培养：倒置相差显微镜下观察，组织块外缘细胞逐渐汇合达80%以上，即可进行首次传代：倒掉培养液，用4 D-Hanks液清洗细胞23遍，弃尽清洗液，加入0.25%胰酶溶液2 mL，孵箱内静置。约5 min后，镜下观察大部分贴壁细胞已脱离瓶底，边缘透亮

7、，胞质回缩，轻晃瓶身可使剩余贴壁细胞掉落。加入含20%胎牛血清的DMEM培养液终止消化，形成的细胞悬液以 110×106/mL接种，每3天换液1次。根据作者经验，1瓶生长良好原代细胞每次可以传代约45瓶。1.3.3 ASMC的纯化：在组织取材过程中注意结缔组织的剥离去除， 在保留平滑肌的前提下尽量干净地刮除内外膜。在培养过程中利用平滑肌细胞的增殖优势， 抑制其他细胞的生长， 随着传代的次数增加，平滑肌纯度会逐渐增高。胶原酶-胰酶混合消化法尽量去除了杂细胞，如上皮细胞及成纤维细胞，故培养出的细胞纯度很高，无需再人工纯化。用贴块法培养出的细胞，含有较多上皮及成纤维细胞。1.3.4 ASM

8、C鉴定：气道平滑肌-actin免疫组化SP法(链霉菌抗生物素蛋白趸噶酉低?染色呈阳性，证实为ASMC。具体操作：取25代ASMC，传代接种至预先放置于6孔板内的盖玻片上， 待生长至致密单层后， 作-actin免疫细胞化学染色：多聚甲醛固定20 min；蒸馏水洗玻片3 min×3次；0.6% H2O2洗30 min；0.01 mol/L PBS液洗2 min×3 次；滴加正常山羊血清，室温20 min，不洗；滴加小鼠抗大鼠SM-actin单克隆抗体(一抗，需完全覆盖盖玻片），37 孵育1 h；0.01 mol/LPBS液洗2 min×3次；滴加小鼠生物素化二抗（需完

9、全覆盖盖玻片），孵育10 min；0.01 mol/L PBS 液洗2 min×3次；滴加HRP标记链亲和素，孵育10 min；0.01 mol/L PBS液洗2 min×3次；滴加DAB显色剂，室温显色25 min；自来水充分冲洗；苏木素复染，盐酸酒精透明；镜检。2 结果2.1 ASMC生长情况 酶消化法培养的平滑肌细胞，静置1 d后开始贴壁伸展，培养23 d后，大部分悬浮细胞已贴壁，呈梭形或长梭形（见图1），换液后继续培养3 d，贴壁细胞完全伸展，细胞伸出较长的突起并相互接触，培养79 d细胞铺满瓶底，部分区域可见典型的“峰谷”样结构(见图2)。贴块法培养的平滑肌细胞3

10、7 d开始以垂直方向从组织块边缘迁移萌出；710 d当组织块中大部分细胞萌出后，组织块便自行脱离，出现“峰-谷”结构，这是平滑肌细胞的特征性生长表现；1014 d细胞相互合；传代细胞的生长特性与原代细胞基本相同，细胞传代的间隔期一般为36 d，若长势良好，3 d即可铺满瓶底。2.2 ASMC鉴定 细胞形态学鉴定：应用倒置相差显微镜观察，ASMC未汇合之前多呈梭形或多边形，内有12个细胞核，可向细胞密度低的方向伸出一至数个足突。细胞汇合后部分区域细胞束状排列， 相互穿插，呈现起伏状生长，呈典型“峰谷”状。免疫细胞化学鉴定: 对平滑肌细胞特异的-actin进行免疫组化SP法染色，显微镜观察，95%

11、以上细胞呈强阳性染色，胞浆呈棕黄色或者棕红色，胞核呈蓝色(见图3)。3 讨论成功分离、培养哮喘大鼠ASMC为了解哮喘生物学方面问题提供了非常有效的模型。本试验以组织贴块法、酶解离法均培养出大鼠ASMC，笔者认为酶解离法培养出ASMC细胞生长速度快，纯度高，基本不需再人工纯化，经鉴定第三代细胞纯度可达95%以上，培养方法具有一定推广重复价值。原代培养的要点是要获得高纯度的ASMC，且不损伤细胞活力，几点技巧总结如下。3.1 培养方法比较 酶消化法可快速获得稳定数量的ASMC，不过平滑肌细胞较脆弱，消化时间较难掌控。胰酶的主要作用是使细胞间的蛋白质水解，使细胞相互离散。胰酶消化时间最好为1025

12、min，消化耐受时间一般不超过0.5 h，并且使用酶的批次不同、存放时间长短不同、甚至实验室的环境不同均会对消化时间产生影响，可根据具体情况适当增减时间，常用浓度为0.25%。胶原酶消化作用较温和，它能在生理pH和温度条件下特异性地水解天然胶原蛋白的三维螺旋结构，却不损伤其他蛋白质和组织。消化1560 min效果均较好，文献报道称胶原酶消化时间可长达1 d，常用浓度为12 mg/mL。根据笔者经验，胶原酶-胰酶混合消化法效果最好。贴块法细胞萌出时间漫长，且原代培养时细胞密度不均匀，故需大量细胞培养时一般不采用此法。3.2 组织取材 气道越向下，平滑肌含量相对越多。如何取细小的支气管平滑肌标本，

13、并除去其内膜和外膜而取得较纯的气道原代平滑肌细胞是ASMC培养的难点。因此在处理组织过程中注意要尽量去除气管周围脂肪和结缔组织， 内外膜尽可能刮除干净，否则容易长出成纤维细胞、上皮细胞等杂细胞，人工纯化效果并不十分理想。使用眼科虹膜剪处理组织块，能更快速地将组织块剪得均匀细小，增加与酶的接触表面积，提高消化效率。3.3 原代培养 培养液只需满过组织即可，一般12 mL，不可多加，否则静置后细胞及组织块易悬浮，不易贴壁。若液体不够，可在细胞贴壁后再临时添加。一般头3 d需要绝对静置，等待细胞贴壁牢固后方可换液。原代培养时对细胞密度的要求其实并不严格，只要有少量细胞贴壁就能生长至贴满瓶底，浓度高则

14、传代速度快些，照本方法，1瓶原代细胞可传45瓶，3 d内就能长满。3.4 传代培养 在传代过程中胰酶消化5 min即可， 否则对细胞损伤太大。镜下观察细胞悬浮于液体中，胞质回缩，如还有细胞贴附于瓶底，可轻轻晃动瓶身，细胞便会掉落。传代过程中胰酶消化后可直接加培养基终止消化，直接培养。很多文献报道称其还需离心，笔者认为离心后弃去的上清液中有不少悬浮细胞，会造成浪费。3.5 无菌操作 本试验的关键点在于坚持做好每一步骤的无菌操作，否则一旦发生污染很难查找污染源，且有可能殃及培养箱内其余细胞。【参考文献】 1 丁敏娇,戴元荣.糖皮质激素防治支气管哮喘患者气道重塑的研究进展J .中华结核和呼吸杂志,2005,28(9):656?58.2 张维溪,李昌崇.气道重塑与儿童哮喘J.中华儿科杂志,2006,44(8):632?35. 3 司徒镇强.细胞培养M.2版.北京:世界图书出版社,2007:69-71.4 卢圣栋.现代分子生物学实验技术M.2版.北京:中国协和医科大学出版社,1999:439- 441.5 Palmans E, Kips JC, Pauwels