先天性巨结肠神经生长因子mRNA表达水平的RT-PCR研究

1、先天性巨结肠神经生长因子mRNA表达水平的RT-PCR研究摘要目的： 探讨神经生长因子(NGF)的生物作用与先天性巨结肠症发病机制间的关系。方法： 采用加入一定量化因素的RT-PCR技术检测了8例先天性巨结肠症、 1例神经节细胞过少症以及1例肠神经元发育不良症不同节段肠组织NGF mRNA的表达水平。结果： 无神经节细胞的巨结肠狭窄段和节细胞过少的肠组织与扩张段近端正常肠组织相比， 其NGF mRNA表达水平降低， 阳性率分别是2/9和8/9， 肠神经元发育不良的病变肠组织NGF mRNA表达水平亦有下调趋势。结论： NGF与肠神经系统发育关系密切， NGF mRNA表达的异常可能参与先天性巨

2、结肠的发病机制； 但无节细胞症是多因素综合作用的结果， NGF也许仅影响节细胞功能的成熟。关键词巨结肠， 先天性神经生长因子逆转录聚合酶链反应 RT-PCR Study of Expression of NGF in Hirschsprungs DiseaseLi Jie, Zhang Xiansheng, Gao Ya, et al.Department of Pediatric Surgery, Second Affiliated Hospital, Xian Medical University, Xian 710004AbstractObjective: The aim of the

3、study is to investigate the relationship between the nerve growth factor(NGF)and pathogenesis of Hirschsprungs disease. Methods: The expression of NGF mRNA was studied with RT-PCR technique in 8 specimens of Hirschsprungs disease, 1 specimen of hypoganglionosis and 1 specimen of intestinal neuronal

4、dysplasia(IND). Results: The expression of NGF mRNA in aganglionic and hypoganglionic colon(2/9) was less than that in the proximal normal colon(8/9) and normal control. The IND specimen also showed decreased expression. Conclusions: The study suggests that NGF may be involved in development of ente

5、ric nerve system. Abnormality in NGF expression may be related to the pathogenesis of Hirschsprungs disease, and affect the maturation of ganglion cells.Key wordsHirschsprungs diseaseNerve growth factorReverse transcription polymerase chain reaction先天性巨结肠症(Hirschsprungs disease, HD)痉挛段肠管神经节细胞缺如的原因尚不

6、清楚。有关移行停滞假说、 缺血假说和微环境假说都未能确切地解释该病的发病机制。有证据表明， 神经生长因子(NGF)是一种最早发现的靶源性神经营养因子， 其在肠组织内蛋白和mRNA水平均有表达， 并且巨结肠模型鼠的病变肠组织NGF免疫染色不同于正常肠组织1。本文通过RT-PCR技术对人狭窄段和扩张段近端正常肠组织标本NGF mRNA表达水平进行检测和比较， 以探讨NGF与HD肠神经节细胞缺如的发病机制的关系。资料与方法一、 临床资料：收集1996年8月至1997年2月西安地区收治的临床诊断为HD的患儿共10例(男9例， 女1例)， 年龄9个月5岁。术中无菌留取切除的狭窄段、 扩张段近端的肠组织，

7、 液氮中速冻后-70保存待用。术后病理诊断： 符合HD者8例， 神经节细胞过少症(hypoganglionosis)和肠神经元发育不良症(intestinal neuronal dysplasia, IND)各1例。此外， 同法收集正常直肠标本1份为正常对照； NGF有较高表达的脑组织标本1份作阳性对照。二、 mRNA分析：1. 肠组织总RNA的提取： 肠组织(-70)约1.0 cm1.0 cm大小于预冷的乳钵中， 加入1.0 ml变性液， 迅速研磨成匀浆， 用皮试针头抽吸1520次使成乳糜状。采用AGPC快速一步法(异硫氰酸胍， Gibco公司， 德国)提取组织总RNA。紫外光栅分光光度仪(

8、上海第三仪器厂， 752型)测定260.0 nm、 280.0 nm的OD值， 计算浓度C=OD26040 (mg/ml)以及OD260/OD280值， 采用琼脂糖凝胶电泳法观察RNA的完整性。总RNA经乙醇沉淀、 回收、 定量后用DEPC水稀释成1 mg/ml的溶液。2. RT-PCR： 逆转录反应(RT)： 总体积20.0 ml， 含样品总RNA1.0 ml(1.0 mg)， AMV逆转录酶(Promega公司， 美国)5U， RNasin(华美生物工程工司)20 U， 随机引物Randerm 9 mer(TaKaRa公司， 日本)2.5 mmol/L， dNTPs(TaKaRa公司， 日

9、本)1.0 mol/L， 5RT Buffer 4.0 ml。42温浴1小时， 95灭活逆转录酶10分钟。聚合酶链反应(PCR)： RT产物分两个反应体系分别对NGF和-actin进行扩增。NGF特异性寡核苷酸引物序列为： Primer 15CCA TAT GTC ATC ATC CCA TCC CAT C 3， Primer 25CGG ATC CTT AGG CTC TTC TCA CAG CCT 3， 扩增片段为380 bps; -actin特异寡核苷酸引物序列为： Primer 15CGC GAG AAG ATG ACC CAG AGC ATG3, Primer 25AGG ATC T

10、TC ATG AGG TAG TCA GT 3, 扩增片为233 bps。各反应体系总体积均为50.0 ml， 组分如下： cDNA 5.0 ml, 引物P1、 P20.4 mmol/L， dNTPs0.2 mmol/L， 10Buffer 5 ml， MgCl22.5 mmol/L。热循环(西安顺达电子有限公司热循环仪， SX-240C)采用高温启动， 即首次变性后加入Taq DNA聚合酶(华美)2.5 U。热循环参数： 97预变性7分钟， 95变性1分钟， 55复性1分钟， 72延伸2分钟， 40个循环后72延伸8分钟。扩增产物采用琼脂糖凝胶电泳溴化乙锭染色法观察并拍照。对照： 以狭窄段病

11、变肠组织为观察组， HD扩张段近端正常结肠组织为自身对照， 正常直肠组织为正常对照， 脑组织总RNA为阳性对照， 去离子无菌水为阴性对照， 对-actin扩增作为质控。结果紫外分光光度仪测定提取的总RNA的OD260/OD280的值达到1.71.9之间， RNA电泳清晰显示rRNA的28 s， 18 s， 5 s三亚基的3条带及其间的拖带， 说明总RNA的纯度和完整性良好。在8例HD、 1例神经节细胞过少症的肠组织NGF mRNA的检测中， 狭窄段阳性检出率为2/9， 而扩张段近端正常肠组织阳性检出率为8/9， 在两段肠管均显阳性时， 前者阳性带亮度亦弱于后者。IND切除之狭窄段和扩张段均表现

12、出一致的病理改变， NGF mRNA的检测均为阴性； 正常直肠NGF mRNA扩增呈强阳性， 且重复实验得到相同的结果。-actin在各反应体系里扩增的结果基本一致， 说明PCR反应基本真实地反映了NGF在组织内的表达水平。讨论肠神经节细胞和神经胶质细胞共同构成的肠神经系统(enteric neural system, ENS)， 是胚胎期由神经嵴细胞从原肠口端向尾端迁移、 定位， 而后分化而来。对HD的模型鼠的研究表明， 病变肠管局部微环境不利于神经嵴细胞继续发育和正常存活2。近年来许多研究致力于发现和阐明微环境中异常的局部因子及其作用。本实验采用RT-PCR方法对肠组织NGF mRNA表达

13、情况进行检测， 是因为NGF mRNA在组织内表达的丰度一般很低， 而RT-PCR比Northern杂交更具敏感性。我们在定性检测的基础上加入了一些定量的因素， 包括固定了模板RNA的质量， 反应体系和热循环参数， 使PCR反应更具稳定性和可比性。关于NGF mRNA在肠组织的表达Kuroda等3曾最先作过研究， 但其结果与本实验所得不尽相同， 估计可能与所用引物不同， 扩增的NGF mRNA的目的片段不同有关。在8份HD的正常结肠和1份正常儿童直肠组织内检测到NGF mRNA较高的表达水平， 提示NGF可能参与ENS的正常发育。而在节细胞缺如和过少的肠组织， NGF mRNA表达水平呈现下调

14、的趋势。由于组织细胞对蛋白质表达主要在转录水平调节， NGF mRNA表达的下调将直接影响NGF的生成。结果提示HD神经节细胞缺如可能与节段性肠管NGF mRNA表达下调有关。有研究4表明， 在人胚的第12周， 远端直肠已能检测出克隆化的神经节前体细胞。NGF高亲和力受体TrkA则在胚胎第19周才检测到， 而生后正常肠管ENS细胞上均可检测出NGF和TrkA5， 提示NGF可能是通过影响迁移后神经节前体细胞的增生、 存活、 功能维持而发挥作用的。根据神经营养理论6及其与细胞程序性死亡7的关系， 推测节段性NGF mRNA表达的下调可能使处于增生状态的神经节前体细胞得不到足够的神经营养信号， 使

15、发生程序性细胞死亡的规模扩大， 最终导致节细胞减少或完全缺如。但这一解释尚不能说明NGF表达下调亦出现在以节细胞增生为特点的IND的病变肠管。最近的研究又发现神经营养素-3(NT-3)5和NGF低亲和力受体8在HD无节细胞肠管表达也存在异常。可见， HD神经节细胞缺如的发生可能是多因素作用的结果。综上所述， 本研究结果提示， NGF与ENS正常发育关系密切， 可能参与HD的发病机制， 但在多因素共同作用的机制中， NGF可能仅影响到节细胞功能的成熟。本研究仅从神经营养角度对HD发病机理进行了初步探讨， 并且可能给包括IND、 慢性特发性假性肠梗阻及儿童慢性便秘等临床上称类巨结肠症(pseudo

16、 HD)9的一类疾病的病因研究提供了一定的启示。作者单位： 710004西安医科大学第二附属医院小儿外科(第一作者现在北京肿瘤医院放射科， 100036)参考文献1Kuroda T, Hirabayashi T， Fuchimotu Y. The localization of nerve growth factor in intestines of normal rats and megacolonic mice. J Smooth Muscle Res, 1991, 27:401-402.2Jacobs CRJ, Patette RF, Gershon MD, et al. Inabili

17、ty of neural crest cell to colonize the presumptive aganglionic bowel of IS/Is mutant mice. J Comp Neurol, 1987, 255:425-438.3Kuroda T, Veda M, Nakano M, et al. Altered production of nerve growth factor in aganglionic intestines. J Pediatr Surg, 1994, 29:288-293.4Fujimoto T, Hata J, Yokoyama S, et a

18、l. A study of the extracellular martrix protein as the migration pathway of neural crest cell in the gut:analysis in human embryos with a special reference to the pathogenesis of Hirschsprungs disease. J Padiatr Surg, 1989, 24:550-556.5Hoehner JC, Wester T, Pahlman S, et al. Localization of neurotrophins and their high-affinity receptor during human enteric nervous system