miR21在白血病发病过程中的作用研究

1、miR21在白血病发病过程中的作用研究 作者：张帅 王萍玉 尹娟 李有杰 马颖 谢书阳 【摘要】 目的 本实验旨在研究miR21在白血病细胞中表达情况，探讨miR21基因与白血病发病的关系。方法 提取组织中的小于200 bp的RNA,用poly(A)聚合酶在其3末端加尾，再用5带40 nt延伸序列的单碱基锚定OligdT引物进行反转录，然后用特异引物进行realtime PCR扩增，从而检测部分miRNAs在白血病细胞株K562中的表达，并与正常人骨髓表达情况相对比。结果 通过realtime PCR 分析，癌基因miR21在K562细胞中的表达量约为(1.73±0.24）×

2、;105 个拷贝，明显高于正常人骨髓组织中miR21的表达（P0.01）。结论 本研究表明miR21在K562细胞中的表达量增高，可能在白血病的发生过程中起重要作用。 【关键词】 实时定量PCR；miR21；白血病；基因表达 【Abstract】 Objective Studing the expression of miR21 in leukemia cells to explore the relationship between miR21 and development of leukemia. Methods After less than 200bp miRNA was isola

3、ted and added with poly A at 3 UTR by polymerase A, the miRNA was reversely conscripted by using 40 nt specific primers for realtime PCR at 5 end. Then, the expression of miR21 was detected in K562 cells and bone marrow cells of health people.Results The expression level of miR21 in K562 cell was (1

4、.73±0.24）×105 copies, obviously higher than that in health people bone marrow cells by realtime PCR analysis（P0.01）.Conclusion The study demonstrated that the expression of miR21 was upregulated in leukemia cells,which may play an important role in leukemia development. 【Key words】 reatime

5、 PCR, miR21,leukemia，gene expression MicroRNA (miRNA)是近几年在真核生物中发现的一类具有调控功能的非编码RNA，大小约为2125个碱基的单链小分子RNA。miRNA能调节生物体生长、发育和疾病发生过程中有关基因的表达1，2，推测这种小分子调控人类近1/3的基因，平均每个miRNA可调节人类200种不同的mRNA表达，并且多个miRNA能够协调调节一些特殊的靶基因3。研究发现miRNAs在正常血细胞分化过程中发挥着重要作用，因此miRNAs的异常表达可能与血液系统疾病的发生和发展密切相关。 目前，随着生物信息学的发展和靶基因实验的确定，有助于揭

6、示miRNAs在调控正常血细胞分化以及相关血液系统肿瘤中的详细分子机制，miRNAs的检测有望成为某些血液系统肿瘤的诊断方法，miRNAs及其靶基因的表达控制也可能成为治疗某些血液系统肿瘤的手段。本研究旨在应用realtime PCR研究miR21在白血病细胞中表达情况，探讨其与白血病发病的关系。 1 材料与方法 1.1 细胞培养 K562细胞用10%胎牛血清的DMEM培养基，于5%CO2、37 条件下培养。正常人的骨髓细胞由山东省烟台山医院提供。 1.2 小RNA的提取 用mirVanaTMmiRNA提取分离试剂盒 (Ambion公司) 从白血病细胞株K562细胞中分离小片断RNA(200

7、nt)。按说明书步骤，从1×106个细胞中提取出小片段RNA溶解在30 l的无RNA酶水中，紫外分光光度计定量。 1.3 miRNA的克隆和逆转录 取1.5 gRNA和5U多聚（poly）腺苷酸(A)聚合酶置于50 l反应管中，37条件下30 min进行小RNA的多聚腺苷酸化。将带有poly(A)尾的小RNA溶于适量无RNA酶H2O中，在20 l体积中，应用GeneRacer试剂盒SuperScriptTMRT部分进行反转录：10 l带有poly(A)尾的小RNA在1 l反转录引物5GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTG (T)243、1 l dNT

8、P混合物(10 mmol/L)和1 l无菌蒸馏水的孵育作用下，65条件下5 min，冰浴1 min，加入5×buffer 4 l，0.1 mol/L DTT 1 l，200 U/l反转录酶1 l，加水至20 l，42，1 h。最后，反转录酶在70条件下孵育15 min灭活。准备cDNA扩增。 1.4 PCR检测目的miRNA 取上述逆转录得到的cDNA进行PCR扩增：引物：上游引物P1：5TAGCTTATCAGACTGATGT3；下游引物P2：5CGACAGTTGCTATGCGATGCA3。 反应条件：94 预变性3 min，1个循环；94 变性30 s，60 退火30 s，72 延

9、伸20 s，30个循环； 72 延伸10 min，1个循环，琼脂糖凝胶分离DNA片段。 1.5 realtime PCR反应 (SYBRGreen Kit4) 标准品制备：将上述PCR产物连接到T载体上（Invitrogen公司），筛选含有插入片段的载体，将标准品稀释至1×107、1×106、1×105、1×104、1×103copies/l，使用realtime PCR仪测定定量曲线和标准曲线。 反应条件：realtime PCR使用RG3000 system (Corbett Research)，变性:95 10 min，延伸95 30 s

10、，68 30 s，72 30 s，40个循环，测定吸光值。 2 结果 2.1 RTPCR检测miR21在K562细胞中的表达 结果发现miR21在K562细胞中表达量相对较高，见图1。 2.2 克隆的质粒DNA鉴定 提取经筛选的用于制作标准曲线模板的质粒DNA,经过PCR及酶切证实,目的片段已连接至T载体上（图2）。 2.3 realtime PCR 检测miR21在K562细胞中的表达 检测癌基因miR21的表达量约为(1.73±0.24）×105 个拷贝（表1），明显高于对照组。 表1 定量PCR检测miRNA表达量结果 3 讨论 检测miRNA的方法包括Norther

11、n blotting5，mirVanaTM miRNA Detection (Ambion公司产品)，microarray6等，这些基于分子杂交的方法敏感性低，需要的RNA量较大。RTPCR方法是目前检测基因表达最灵敏、可靠的方法，但miRNAs分子太小，用常规的RTPCR检测有局限，需要特殊的设计。 实时荧光定量 PCR技术是在PCR反应体系中加入荧光试剂，利用荧光信号实时检测PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。1991年Holland等7首先报道了运用不可延伸的寡核苷酸杂交探针与模板相结合，然后利用DNA聚合酶53核酸外切酶的活性将探针切断，使探针的能量传递结构破坏发

12、出荧光来定量PCR产物。1996年PE公司在Holland等运用方法的基础上开发出商用实时荧光定量PCR系列，即Taqman PCR系列。实时荧光定量PCR能够专一、灵敏、快速、高重复性地精确定量起始模板浓度。 研究表明，miR21在胶质母细胞瘤中表达增加，这个基因在肿瘤组织中表达量比正常组织高5100倍。反义核酸的研究发现这个miRNA 通过抑制凋亡而并非影响细胞增殖控制细胞生长，这预示着这个miRNA具有癌基因的功能。Volinia等对肺癌、乳腺癌、胃癌等肿瘤细胞进行研究发现，miR20a、miR21、 miR175p等与肿瘤的发生呈正相关。对恶性胆管细胞癌研究发现，癌细胞中miR21、m

13、iR141等表达明显增高，而抑制miR21的表达可以增加肿瘤对化疗药物吉西他滨（gemcitabine）的敏感性9。上述研究说明miR21作为癌基因在多种肿瘤发生过程中起至关重要的作用。 本文通过定量PCR实验，检测了miR21在白血病细胞和正常人骨髓细胞中表达的差异，发现miR21在白血病细胞胞株K562细胞中的表达量增高，推测miR21参与白血病的发生，在白血病的发生发展中可能起重要作用。 【参考文献】 1 Xie X,Lu J,Kulbokas EJ,et al.Systematic discovery of regulatory motifs in human promoters an

14、d 3UTRs by comparison of several mammalsJ.Nature,2005, 434:338345. 2 Lim LP,Lau NC, GarrettEngele P,et al.Microarray analysis shows that some microRNAs down regulate large numbers of target mRNAsJ.Nature, 2005, 433: 769773. 3 Krek A,Grun D,Poy MN,et al.Combinatorial microRNA target predictionsJ.Nat

15、Genet, 2005,37:495500. 4 Xie SY, Ren ZR, Zhang JZ,et al.Restoration of the balanced /globin gene expression in 654thalassemia mice using combined RNAi and antisense RNA approachJ.Hum Mol Genet, 2007,16:26162625. 5 Carrington JC,Ambros V.Role microRNAs inplantand animal developmentJ.Science,2003,301:

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