感受态细胞制备及各种感受态的特点

1、感受态细胞制备制备感受态常用得方法就是电击法与CaCl 2制备法，以下介绍CaCl 2制备法: 1、可以从80C冰柜中，取出一支冻存菌株，于事先照过紫外得超净台中，用无菌得接种环轻轻蘸取菌种后，在无抗平板（由于Roce t ta含有氮徘素抗性,需要涂布在氯徘素抗性得平板后而得都就是如此）上划线，并将菌种迅速放回8or保存，在划线板上做好相应标记，于37°C培养过夜0 2、从37C培养过夜得新鲜平板上挑取一个单克隆，接种于2mlEP管中,3 7X 2 20rpm震荡培养约6个小时至对数生长中后期;将该菌悬液以1:10 0得比例接种于5 0 ml LB液体培养基（2瓶）中，37°

2、;C振荡培养2、5小时至OD60 0=0、5注意：接种比例不得大于1： 10。3、在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、预冷得离心管（50ml中，在冰上放置51 OmI n：注意：划板、接种为了防止意外发生最好多划一块平扳与多接一根试管，划板、接种、转接 均要严格按照无菌操作.4、49 500 Og离心5分钟。用预冷得去离子水洗涤沉淀，4*0 5000g离心5分钟:Note:此步主要就堆为了洗去培养慕中得盐等5、沉淀加入2m 1预冷得0、0 5mol / L Ca Cl-l 5%甘汕混合溶液，轻吹散，冰浴5分钟，4 0C5OOOg离心5分钟: 6、沉淀加入2m 1预冷得0、05mo 1 /L Ca

3、Cb 1 5%甘汕混合溶液，轻吹散,即成为感受态细胞悬液。分装成5 01 OOM得小份，贮存于一70C可保存半年。含15%甘油得0、05mol/L CaCb制备方法:称取0、28g Ca Cb（无水，分析纯），溶于50ml重蒸水中，加入15ml甘油，崔容至100mI ,高压灭菌感受态细胞得特征感受态：通过特殊处理使细胞处于能够吸收外源DNA得状态。感受态细胞得特征:（1）细胞表而眾直出一些可接受外来DNA得位点（以溶菌酶处理，可促使受体细胞得接受位点充分暴露）。（2 ）细胞膜通透性增加（用钙离子处理,可使膜通透性增加，使DNA直接穿过 质膜进入细胞）0 （3）受体细胞得修饰矗*活性最高,而限制

4、酶活性最低，使转入得DNA分子不易被切除或破坏.实验室常用得感受态细胞仁DH5a菌株 克隆菌株：DH5a就是一种常用于质粒克隆与高拷贝质粒得稳泄复制得菌株.E、col iDH5a在使用pUC系列质粒载体转化时，其（p80lacZAM1 5基因产物可与载体编码得0半乳糖昔酶氨基端实现a-互补，可用于蓝白班筛选鉴别重组菌株。RecA1与e ndA 1得突变有利于克隆DNA得稳与髙纯度质粒DNA得提取。基因型:F、(p80cl 1 acZAM15 A(lacZYA a rgF)U 169. deoR、recAI、e nd A1.hsd R17 (rks m k +)、pho A、sup E4 4 .

5、入、thi1、gy r A 9 6、 relA 1 2、TOP1 0菌加克隆菌株:该菌株适用于高效得DNA克隆与质粒扩增，能保证高拷贝质粒得稳企遗传。A基因型J F、mcrAA (m rrhsd RMSm c rBC)、(p8 0、lacZAM1 5、 1 acX 7 4、recA1 araA139A (ara-1 eu ) 7697、 galU、galK、rps、(St r r) endAI、 n u pG3、BL21 (DES )菌株:蛋白表达菌株：该菌株用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子得表达载体（如pET系 列）得基因。该菌株用于T7 RNA聚合酶为表达系统得高效外源基因得蛋白表达

6、宿主.T7噬菌体RNA聚合酶基因得表达受控于入 噬菌体DE3区得acUV5启动子，该区整合于BL21得染色体上。该菌株适合于非毒性蛋白得表达。基丙型J F、0mpT. hsdS (g me ). gal、dem(DE3) 4、BL21 （DES） pLysS菌株心蛋白表达菌株:该菌株含有质粒p LysS,因此具有氯確素抗性。PLysS含有表达T7溶菌酶得基因，能够降低目得基因得背景表达水平,但不干扰目得 蛋白得表达。该菌适合表达毒性蛋白与非毒性蛋白。基因型J F、ompT、hsds(rs my)、gal、 dcm (DE3)、pLysS、Cam r 5、Rocetta感受态特征:蛋白表达菌株R

7、os e tta系列菌株来源于BL21系列宿主菌，该系列菌株含有原本在大肠杆菌中稀少得貞核细胞密码子，增加了真孩细胞得蛋白表达水平.(1) Ro cet t a CDE3)该菌株通过一个柑容性氯靈素抗性质粒补充大肠杆菌缺乏得6种稀有密码子（AUA、AGG、AGA、CUA. CCC、GGA）对应得tRNA,这样Ro c e tta菌抹提供了 “万能"得翻译,从而避免因大肠杆菌密码子使用频率导致得表达限制，提高外源基因尤英就是真核基因在原 核系统中得表达水平。t RNA基因由它们得天然启动子驱动。基因型 2 F、ompT、hsdSB (严 mB人 gal、d cm、lacY1( D E

8、3 )、p R ARE (argU, argW, i I eX, glyTJe uW,proL)(Cmr)补充 ftSfj密码予对蛋白茨达得影响：CtM酸祁有一个以上得密W子，对e、co! i密码子应用情况分析注明一些密码予很少使用F尤其就足«81酸密码子AGAAGG . CGGCGA： 亮気酸得密码子AU A；亮氨酸得密码子CUA与甘気酸得密码子GGA勺脯気駿得密码子CCC很少被用到目紂基W中含冇过多得有密W子被认为就启低表达水平峙产生不完全产物得一个原因当在氨«端附近出现多个播冇密码子得时帳，情况更为严«许多研亢农明'將埶酸得密码子AGA勺AGG得需频

9、出现可能人人齡响蛋白得产ft。当这些密W子出现在N-端附近时候.这种影响将达到B人.血多个实验窒报道-在宿主硝 中增加同类IRNAW那?含有棉有密W子基W得蛋白产ft将人大槻高株对以增加ffl氨酸稀有密码予AGG与AGA.异亮氨酸符密网子AUA；亮気酸符密W子CUA峙甘氨酸紂密码子GGA与舗瓠酸得密码子CCC W此，很适合用干农达生含巳coli W密码子基因得目得蛋白.(引用FI网址(2) Rose t ta2 (DE3) pLySs来源于 Rose tta(DE3)> 本菌株含有pRARE2质粒,除了能够提供原Rosetta(DE3)宿主菌含有AUA, AGG AGA,CUA. CCC

10、,与GGA六个稀有密码子得tRNA外，还提供了第七个稀有密码子CGG得tRNA。同时,pR A RE 2质粒具有氯瞪素抗性-Ros e tta2 (DE3)pLySs载体通过提供稀有密码子，使得该宿主菌相对于其她大肠杆菌，能够提供更加“通用”得蛋白质表达,从而提升目得蛋白表达水平cDE 3就是溶源性得入DE3,所以带有T7 RNA聚合酶得染色体拷贝0该菌株适用于pET系列载体,及其她T7启动子系列载体含有pLS S质粒，pLySs质粒能够产生T7溶菌酶，可以有效降 低目得基因得基础表达水平。pLySs质粒使得该菌株具有氯霊素抗性0 PL ySs质粒得起始复制位点就是pi 5 Origin,这使

11、得该质粒能够与pUC-及pBR322-衍生得质粒互相共存.转化1、转化得原理：溶液中得Ca离子与细菌细胞膜结合，在低温下形成液晶结构，在42°C,90s热激下，这种液晶结构收縮，将细胞膜扯开孔道，使DNA进入细菌细胞中。2、转化得步骤: (1)取感受态细胞置于冰浴中，如需分装可将刚融化得细胞悬液分装到无菌预冷得离心管中，置于冰浴中.(2)向感受态细胞中加入目得DNA(50ul感受态细胞能够被Ing超螺旋DNA所饱与),轻惮混匀,在冰浴中静置30m i n；注fir 次转化感受;细胞得建议用®为50uh nf以根据实际情况分装使用，应注总所用DNA体枳不能趙过感爻念细胞恳液体

12、积得I分Z -也fj说池就肚不能超过5%.不能加入太多DNA金够响转化效率.体枳不能超过10U1,所以连接时做Wul连接体系可用一半做转化承I卜得放在49.(3 )将离心管置于42度水浴中放置90S.然后快速转移到冰浴中，使细胞冷却2-3min(- 般2m i n)，该过程不要摇动离心管;(4)向毎个离心笛中加入5 OOUI无菌得LB培养基(不含抗生素，混匀后置于3 7度摇床震荡培养4 5min(150r pm),目得就是使质粒上相关得抗性标记基因表达，使菌体复苏。(5)将离心管内容物混匀，可吸取适量(可吸取2 0 0300UI,也可据情况而；)转化产物涂布平板，而如果预il得克隆较少，可通过离心(4000rpm. 2min)后，吸掉部分上淸，悬浮菌体后将其涂