分子克隆操作技术注意事项(20210111042921)

1、分子克隆操作技术注意事项引物设计1. 设计模板：基因过表达的设计模板为mRNA （根据基因名称和样品种属从NCBI 查询） , 启动子（转录调控区域）的设计模板为基因组 DNA 片段（根据基因名称和种属从 UCSC 查询，并在 NCBI 核实序列）， DNA 甲基化分析（CpG岛，根据基因名称和种属从 UCSC查询，并在NCBI核实序列）;2. 设计软件： Vector NTI 用于设计过表达引物， Vector NTI 用于设计启动子 （转录调控区域）克隆引物; Methprimer 用于设计 DNA 甲基化分析引物（ BSP,MSP)3. 5'和 3'端的酶切位点和保护性碱

2、基所用的载体的多克隆位点（MCS）有，所克隆的序列没有，可以同时做双酶切, 我们的酶库有，价格便宜的，加了保护性碱基可以直接进行 PCR产物酶切的（详 情见保护性碱基 .doc）;引物溶解1.引物的储液浓度为100卩M,计算加入灭菌水的量;2.3.4.引物溶液应-20 C保存;打开管盖前，必须先12000RPM离心2min,因为引物为粉末，容易飘出；加入灭菌水溶解前，应稍微打开管盖即可，以免粉末飘出;5.引物使用的工作液浓度为10卩M,需要多少稀释多少，剩余的应丢弃;PCR1. 操作注意事项：操作前，应熟知所用 PCR 酶的说明书，并熟知说明书标示的 注意事项（引物、模板和酶的建议用量，变性温

3、度及时间，延伸速度等）PCR是极为灵敏的技术，因此要决定避免交叉污染，注意冰上操作，这样可 以提高扩增的特异性;2. 理解掌握每步操作的原理和注意事项;3. PCR实验进行前，应考虑以下几个问题：引物的使用量，引物的反应浓度一般为0.2-1卩M ;模板的用量，各种模板的建议用量参考PCR酶说明书，原则上第一次进行 PCR 反应时，采取中间值;4. PCR常见问题及对策问题原因对策没有任何条带（“白板”）PCR体系中成分是否有 遗漏添加重新进行实验没有目的条带，但有引物二聚体反应效率过低，其中原因 可能是引物与模板的配 比不合适，不是模板加得 越多反应效率就越高，退 火温度过高，导致引物与 模板

4、无法配对调整引物与模板的配比， 一般按照PCR酶的说明 书的建议选择合适的引 物和模板的添加量，降低 退火温度有目的条带，但产量低反应效率低，其中原因可 能是引物与模板的配比 不合适，不是模板加得越 多反应效率就越高，退火 温度高，导致引物与模板 结合配对不稳调整引物与模板的配比， 一般按照PCR酶的说明 书的建议选择合适的引 物和模板的添加量，降低 退火温度有目的条带，但有其他杂 带反应特异性不咼，其中原 因可能是引物设计存在 缺陷，退火温度较低提咼退人温度，如果目的 带与杂带相距较远，产物 产量可以满足下游实验 需要，可不考虑重新设计 引物四、长引物退火产生DNA双链一般通过PCR扩增所需

5、的DNA双链，如果DNA双链胶短（150bp以内），这可 以通过合成互补长引物，并在引物两侧预留 酶切后的酶切位点，通过变性退火程序即可形成互补的DNA双链，一般在制备shRNA编码框，miRNA过表达或干扰编码框时，可以采取上述策略;五、全基因合成如果通过PCR技术无法获取目标DNA片段，我们一般委托DNA合成公司进行全基因合成， 只需告知我们需要合成的序列， 并在序列的两侧加上克隆所需的酶 切位点，服务公司合成后将克隆至克隆载体中， 我们收到重组克隆载体 （我们自 己需要进行酶切鉴定和测序鉴定） ，需要利用预留的酶切位点亚克隆至我们的目标载体中，然后进行酶切鉴定和测序鉴定；、.六、琼脂凝胶

6、电泳1.2.作用：PCR产物鉴定，酶切产物鉴定，胶回收纯化 PCR或酶切产物;3.胶浓度：一般为 1%，根据分析产物的大小选择合适的胶浓度；电压：电压高，泳动速度快，耗时短，但产热量大，容易烧胶，条带模糊，电压低，泳动速度慢，耗时长，但产热量小，条带清晰，应根据实际情况选择合适的电压；4.电泳缓冲液： 加入电泳缓冲液的量高过胶面 1厘米以上，如果进行胶回收时， 必须使用新的电泳缓冲液液，这是为了避免污染（电泳槽和胶槽也需清洗干 净并用超纯水润洗）和提高回收效率（旧电泳缓冲液的PH环境不利用DNA回收）；5.理解掌握每步操作的原理和注意事项；七、 酶切1.DNA 的用量： 一般使用 0.5-1u

7、g, 这样可以保证条带清晰，切产物中有目的条带小于250b P使用考虑使用较多DNA酶切充分； 如果酶 进行酶切，否则目的条带不清晰；2.限制性内切酶的用量：根据酶的活性单位进行添加，一般1ul 酶含 10 个活性国际单位，可以在 1 小时内充分酶切 1ugDNA ，一般酶的用量不能超过酶切体系的 1/10 体积，否则产生星活性（酶切不特异）3.酶切体系：酶切总体系一般为 20-30ul ，体系大，可以使抑制酶切的因素稀释， 但做琼脂糖凝胶电泳时需要配制较厚的胶，根据 DNA 的浓度和纯度选择合适的酶切体系；4.缓冲液：根据限制性内切酶厂家的要求选择合适的缓冲液（buffer），进行双酶切时，

8、查询厂家提供的双酶切反应缓冲液表格即可;5.理解掌握每步操作的原理和注意事项；八、DNA 片段纯化1.PCR产物，酶切产物，酶修饰产物，如需进行下一步酶学操作，必须先进行 纯化回收；2.方法：胶回收纯化试剂盒或 PCR 产物回收纯化试剂盒， 胶回收纯化试剂盒是 通用试剂盒，适用于所有情况， PCR 产物回收纯化试剂盒只适用于产物中片段特异的情况，例如 PCR 产物特异，酶切产物大小特异，修饰酶产物；3.4.进行胶回收时注意紫外线照射时间勿超过 60S，否则导致DNA片段突变;理解掌握每步操作的原理和注意事项；九、去磷酸化1. 单酶切的载体或目的片段进行连接时， 它们各自在体内和体外容易进行自连

9、， 为防止自连，必须利用磷酸化酶（CIP）进行去磷酸化处理；2. 理解掌握每步操作的原理和注意事项；十、 磷酸化处理1. 某些情况下，如果该片段的末端没有磷酸基团，自连是无法发生的，如需要 对片段进行自连，则需要利用激酶进行磷酸化处理;2. 理解掌握每步操作的原理和注意事项；DNA 连接1. 载体片段与目的片段的用量： 目的片段与载体片段的摩尔比应大于 3:1，小于10:1，载体片段与目的片段的总用量因大于 50ng 小于 200ng;2. 连接体系：总连接体系一般为10-20UI,体系小，载体片段与目的片段的碰撞几率提高，从而提高连接效率，在各种条件满足的条件下，尽量进行小体系连接；3. 连

10、接时间和连接温度： 参考连接酶的操作指南， 如果片段的两端均为粘末端， 可进行室温短时间连接，如果片段的两端有一端或两端为平末端，应进行低温长时间连接；4. 理解掌握每步操作的原理和注意事项；十二、 感受态细胞制备1. 感受态细胞种类：热击感受态细胞（ CaCl2 法），电击感受态细胞（ 10%甘油 法）;2. 细菌转接：复苏的细菌切勿培养超过16h，否则细菌太老了，活力极差；转接比例应控制在 1:500-1:1000，这样保证后续生长的细菌的活力，转接培养体积，根据实际需要决定，但培养体积不可超过培养器皿总体积的1/3；3. 细菌生长条件：严格按照目的细菌的生长温度，保证振荡速度不低于225

11、RPM,这样可以保证换氧充分，生长旺盛;4. 细菌生长密度：如果进行热击感受态细胞制备， 菌液的 OD600 值应为 0.2-0.3， 肉眼观察到现象为云雾状， 如果进行电击感受态细胞制备， 菌液的 OD600 值应为 0.5-0.6，肉眼观察到现象为浓云雾状；5. 离心操作：随着离心操作次数的增加，细菌会变得越来越脆弱和松散，所以 在进行吸液操作时应极为小心， 在保证不吸走细菌的前提下， 尽量移除上清;6. 无菌操作：注意无菌操作，注意别离酒精灯火焰太近，否则导致细菌烫死;7. 理解掌握每步操作的原理和注意事项;十三、转化1. 转化方法：热击转化和电击转化;2. 注意事项：无菌操作，冰上操作

12、，快速操作;3. 感受态细菌与 DNA （连接产物或质粒）复合时，应把 DNA 加入感受态细菌 中，并在冰上放置一段时间，以保证 DNA 与感受态细菌的表面从分接触;4. 理解掌握每步操作的原理和注意事项;十四、 平板克隆筛选1. 抗生素平板制备：加入抗生素时，注意培养基的温度，太高容易导致抗生素热失活，太低容易导致培养基提取凝固，从而不能进行倒板操作;为控制合适的温度， 应不时摇晃瓶子， 这样保证培养基的温度与瓶子表面的温度一致，用手感知瓶子表面的温度，以不烫手为宜;2. 菌液涂布：加入合适的菌液并涂布均匀，菌液加多了，平板不易涂布均匀和干燥，加上转化效率较高，则导致菌落太密，菌液加少了，平

13、板不易涂布均匀，加上转化效率较低，则导致菌落太稀疏，因转化效率不能提前得知，为保证成功率，可进行梯度涂板;3. 培养条件：培养温度按照该细菌的生长温度，倒扣培养，切勿正置培养，培养时间一般不超过12-16h,否则容易长出卫星菌（细菌发生突变了），后期加强观察，根据菌落大小随时取出，并倒扣（并用封口膜封口）放置于4C4. 克隆平板从4C取出时或后面的观察和使用操作均需保证平板倒扣放置，否则平板上的冷凝水与克隆接触，从而导致菌落交叉污染；5. 理解掌握每步操作的原理和注意事项；十五、 细菌培养 1.接种：用牙签挑取菌落（放置于 4C下超过2周的菌落不易使用）并在培养基中润洗，或用枪头吹打甘油菌（在

14、-80 C下放置），然后枪头在培养基中润洗；培养体积不可超过培养器皿总体积的 1/3； 2. 培养条件：严格按照目的细菌的生长温度，保证振荡速度不低于 225RPM，这样可以保证换氧充分， 生长旺盛；培养时间不要超过 16小时， 否则细菌老 化，抗性丢失，质粒产量严重降低；3. 理解掌握每步操作的原理和注意事项；十六、 质粒提取1. 提取试剂盒：如果提取的质粒只需进行酶切鉴定，请使用 OMEGA 厂家或其 它国产生产厂家生产的小量试剂盒即可，如果提取的质粒需进行细胞转染，请使用 QIAGEN 厂家生产的中量提取试剂盒， 这样可以包装足够的产量和纯度（超螺旋结构，具有转染活性） ；2. 用于质粒

15、提取的细菌的培养时间不要超过 16 小时；3. 注意事项：不是用于提取质粒的菌量越多，质粒的产量就越多，因为质粒提取试剂盒的每份试剂的能力是有限的，超过每份试剂的能力，反而导致产量减低；4. 理解掌握每步操作的原理和注意事项；十七、酶切鉴定1. DNA 的用量：一般使用 0.5-1ug, 这样可以保证条带清晰，酶切充分；如果酶切产物中有目的条带小于250bP,使用考虑使用较多DNA进行酶切，否则目的 条带不清晰；2. 限制性内切酶的用量： 根据酶的活性单位进行添加， 一般 1ul 酶含 10 个活性 国际单位，可以在 1 小时内充分酶切 1ugDNA ，一般酶的用量不能超过酶切体系的 1/10 体积，否则产生星活性（酶切不特异）3. 酶切体系：酶切总体系一般为 20-30ul,体系大，可以使抑制酶切的因素稀释，但做琼脂糖凝胶电泳时需要配制较厚的胶，根据 DNA 的浓度和纯度选择合 适的酶切体系；4. 缓冲液：根据限制性内切酶厂家的要求选择合适的缓冲液（buffer），进行双酶切时，查询厂家提供的双酶切反应缓冲液表格即可；5.