测定静脉注射人免疫球蛋白IgG含量的三种方法比较

1、测定静脉注射人免疫球蛋白 IgG 含量的三种方法比较 王 淼 , 薛巧如 , 姚敏菲 , 谢正福 摘 要 目的 对检测静脉注射人免疫球蛋白中 I gG 含量的 3种方法进行比较 。 方法 采用紫外分光光度法 、 酶联 免疫法 、 高效亲和色谱法对静脉注射人免疫球蛋白进行 I gG 含量测定 。 结果 紫外分光光度法与高效亲和色谱法及酶联免疫 法之间有显著性差异 , 高效亲和色谱法与酶联免疫法之间无显著性差异 , 高效亲和色谱法的重复性较好 , RS D 为 0. 8%。 结论 为选定静脉注射人免疫球蛋白中 I gG 含量测定方法提供了依据 。 关键词 I gG; 高效亲和色谱法 ; 紫外分光光

2、度法 ; 酶联免疫法 中图分类号 R927. 2 文献标志码 A 文章编号 100829926(2010 0620517204 DOI 10. 3969/j . issn . 100829926. 2010. 06. 014A Co m par ison of Three M ethods for D eterm i n a ti on of the Con ten t of Ig G i n Hu man Im m unoglobuli n Prepara ti on s for I n travenous I n jecti on(IV IG WANG M iao , XUE Q iao

3、2ru , Y AO M in 2fei , X I E Zheng 2fu Guangdong I nstitute f or D rug Contr ol, 510180, School of Che m istry and Che m ical Engineering of Sun Sen China; Guangdong Food and D rug Ad m inistrati on Center for 510080, China Abstract O bjecti ve To co mpare on of the content of I gG in intravenous in

4、 2 jecti on . M ethods H igh 2perfor the i m munos orbent assay and ultravi olet s pectr ophot ome 2 try were used t o I in injecti on . Results The statistical analysis showed that there was w een the results obtained fr om ultravi olet s pectr ophot ometry, high 2perf or mance af 2 finity and the

5、linked i m munos orbent assay, but no significant difference bet w een the results of high 2perf or m 2 ance affinity and the enzy me 2linked i m munos orbent assay . The result of the rep r oducible test fr om high 2perfor mance affinity was the best a mong the three methods . Conclusi on This stud

6、y hel p s choose a p r oper method t o deter m ine the content of I gG in intravenous injecti on . Key words I gG; high 2perf or mance affinity; ultravi olet s pectr ophot ometry; enzy me 2linked i m munos orbent assay I gG 是机体免疫中起保护作用的重要抗体 , 可抗 菌、 抗病毒 ; 应对麻疹、 甲型肝炎等 , 能有效地预防相 应的感染性疾病。 I gG 是静脉注射人免疫球

7、蛋白的 主要成分 , 测定 I gG 含量对静脉注射人免疫球蛋白的 质量控制很关键 1, 2。 I gG 的检测方法很多 , 本文采 用紫外分光光度法、 酶联免疫法、 高效亲和色谱法 3种不同原理的分析方法 , 对静脉注射人免疫球蛋白中 I gG 进行含量测定 , 考查各方法并对结果作比较 , 为 静脉注射人免疫球蛋白的质量监控提供依据。作者简介 :王 淼 , 硕士 , 主管药师。研究方向 :生物制品及生化药 品标准研究 。 Tel:(020 81887684; E 2mail:wm8077hotm ail . com 作者单位 : 510180广东广州 , 广东省药品检验所生化室 ; 510

8、275广东广州 , 中山大学化学与化学工程学院 ; 510080广东 广州 , 广东省食品药品监督管理局审评认证中心 1 仪器与试药 UV 22550紫外可见分光光度计 (日本岛津制作 所 ; 1100系 列 高 效 液 相 色 谱 仪 、 紫 外 检 测 器 (VWD (美国安捷伦公司 ; Sepctre Max 190酶标仪 (美国分子仪器公司 ; H iTrap T M Pr otein G HP (1m l 色谱柱 (GE Healthcare ; 人免疫球蛋白 (I gG EL I S A 定量试剂盒 (美国 R&D 公司 ; M illi 2Q 超纯水仪 (M ill po

9、re ; 正常人血清免疫球蛋白国家标准品 (中 国药品生物制品检定所 , 批号 :20030101 ; 冻干抗人 I gG 血 清 (中 国 药 品 生 物 制 品 检 定 所 , 批 号 : 20070101 ; 静脉注射人免疫球蛋白 (不同厂家的 5批 样 品 , 批 号 分 别 为 :200909413、 200909414、 200909716、 200909719、 20091010 ; PEG6000(广州 7 1 5 解放军药学学报 2010年 12月 20日 第 26卷 第 6期 Phar m J Chin PLA, VO l . 26, NO. 6, D ece m ber

10、20, 2010 天马精细化工厂 ; Tris (Sanland 2Che m ; 其余试剂均 为分析纯 。2 方法与结果2. 1 紫外分光光度法 32. 1. 1 溶液的制备 (1 抗体缓冲液 称取 Tris 12. 42g 、 NaCl 9g 、 PEG600050g 、 B S A 1g 、 NaN 3 1g, 加水溶解 , 用 1mol/L盐酸调 pH 至 7. 4, 加水 稀释至 1L 。 (2 抗体液 用抗体缓冲液将冻干抗 人 I gG 血清溶解并稀释成抗体效价为 1 4, 混匀 , 0. 45m 膜滤过 , 4 保存备用 。 (3 标准品溶液 用生理氯化钠溶液将 I gG 国家标

11、准品进行梯度 稀释 , 将样品进行 20、 30、 40倍稀释 , 取稀释的样 品和标准品各 10l 于试管中 , 加入预热至 37 的 抗体液 1m l 混匀 , 37 水浴保温 1h 。 340nm 波长 测定吸收值 。2. 1. 2 线性关系考察 将 I gG 国家标准品依次稀 释成 4. 2、 2. 1、 1. 05、 0. 52、 0. 26mg/ml, 按上述方法 进行试验 , 得标准曲线方程为 : Y =0. 7821X -0. 1992, R 2=0. 结果表明 I gG 在 2关系良好 。2. 1. 3重 验 同 一 批 号 (批 号 : 200909413 6次 , 6次测

12、 得的 I gG 含量平均值为 51. 0mg/ml, RS D 为 2. 6%。 2. 1. 4 回收率试验 取已测定含量的静注人免疫 球蛋白 (批号 :200909413 供试品溶液 , 分别加入 3种不同量的 I gG 标准品溶液 , 分别测定 , 结果见表 1。表 1 回收率试验测定结果 (n =9样品量 ( 加入量(测得量(回收率(x(RS D (1. 021. 202. 311107. 61. 202. 352111. 01. 202. 250102. 51. 021. 002. 158113. 81. 002. 225120. 5113. 35. 6 1. 002. 248122

13、. 81. 020. 801. 964118. 00. 801. 909111. 10. 801. 918112. 32. 1. 5 含量测定 取静脉注射人免疫球蛋白供试 品 5批 , 按本文方法进行测定 , 计算供试品中 I gG 的 含量 , 结果见表 2。表 2 含量测定结果 (n =2批号 I gG 含量 (mg/ml 20090941351. 020090941451. 320090971653. 120090971952. 12009101049. 72. 2 高效亲和色谱法2. 2. 1溶液的 制备 (1 流 动 相 A 液 0. 05 mol/L磷酸盐缓冲液用氢氧化钠调至 pH

14、6. 5; (2 流 动相 B 液 0. 07mol/L甘氨酸 2盐 酸缓冲液用盐酸 调至 pH2. 5; (3 对照品溶液 球蛋白国家标准品 ,度为 1. l 精 1. 0, 用注射 l0. 45m 滤膜 。. 2色谱条件 色谱柱 :H iTrap T M Pr otein G HP 色谱 柱 ; 检 测 波 长 :280n m; 柱 温 :25 ; 进 样 量 : 20l; 流速 :0. 4m l/min; 梯度洗脱程序 , 见表 3。 表 3 梯度洗脱表时间(流速(A(B(0. 000. 410004. 500. 410005. 500. 4010015. 000. 4010015. 5

15、00. 4100023. 000. 410002. 2. 3 系统适用性试验 按上述色谱条件进样 , 得 对照品 、 供试品及空白图谱 , 见图 1, 空白无干扰 , 理 论板数按 I gG 峰计算可达 10000以上 , 且与相邻杂 质峰的分离度均能达到要求 。2. 2. 4 精密度试验 取 I gG 对照品溶液 20l, 连 续进样 6次 , 记录峰面积 , 并计算 RS D 为 0. 5%, 表 明该方法的精密度较好 。2. 2. 5 线性关系考察 取 I gG 标准品依次稀释成 浓度为 2. 0、 1. 5、 1. 0、 0. 5、 0. 25mg/ml 的溶液 , 分别 进样 20l

16、, 平行进样 2次 。 以峰面积对浓度进行回 归 , 得回归曲线和回归方程为 : Y =5731. 4X -51. 7, R 2=0. 9998815 解放军药学学报 2010年 12月 20日 第 26卷 第 6期 Phar m J Chin PLA, VO l . 26, NO. 6, D ece m ber 20, 2010 A:对照品 ; B:供试品 ; C:空白 ; 1:lgG图 1 HP LC 色谱图 线性试验结果显示 , 在 0. 252. 0mg/ml 浓度 范围内 , I gG 峰面积与浓度呈现良好的线性关系 2. 2. 6 稳定性试验 3、 612、 24h 分别进样 20

17、, 前 3次进样 I gG 1. , 6次进样 I gG 5. 。说明供试品溶液在配制后 6h , 则溶液制 备后应及时进样 。2. 2. 7重 复 性 试 验 取 同 一 批 号 (批 号 :200909413 样品 , 制备 6份供试品溶液 , 测定 , 6份 供试品 I gG 平均含量为 40. 2mg/ml, RS D 为 0. 8%。 结果显示该方法的重复性良好 。2. 2. 8 检测限与定量限 取对照品溶液稀释至适当浓度 , 进样 , 以 I gG 的峰达信噪比 23和 810倍时的量分别为最低检测限和最低定量限 , 最低检 测限为 2g, 最低定量限为 6g 。2. 2. 9 回

18、收率试验 取已测定含量的静脉注射人免疫球蛋白 (批号 :20090413 供试品溶液 , 分别加 入 3种不同量的 I gG 标准品溶液 , 分别进样 , 结果见 表 4。2. 2. 10 样品测定 取静脉注射人免疫球蛋白供试品 5批 , 按本文方法进行测定 , 记录色谱图 , 计算供 试品中 I gG 的含量 , 结果见表 5。2. 3 酶联免疫法 (E L I S A 4 本法采用人免疫球 蛋白 (I gG EL I S A 定量试剂盒 , 操作照说明书步骤进 行 , 将标准品稀释成 60、 40、 20、 10、 5g/ml 5个浓 度 , 于 96孔酶标板中每孔加入 50l 标准品和待

19、测样品 , 各重复 2孔 , 37 孵育 30m in, 加入底物 T MB显色 15m in, 终止反应 , 450nm 测定吸收值 , 据校准 曲线计算出待测样品的 I gG 含量 。表 4 回收率试验测定结果 (n =9样品量( 加入量( 测得量( 回收率(x (RS D (0. 500. 320. 822100. 60. 80896. 30. 81197. 20. 500. 400. 86992. 397. 32. 50. 88796. 80. 89398. 30. 500. 480. 97398. 50. 96296. 30. 97999. 85 (=2批号I gG 含量 (mg/m

20、l 39. 02. 3. 1 线性关系考察 将标准品依次稀释成 5个浓度 , 按上述方法进行试验 , 以浓度对吸收值进行回归 , 得标准曲线方程 : Y =0. 003X +0. 0408, R 2=0. 989 结果表明 I gG 在 560g/ml 范围内线性关系 良好 。 2. 3. 2 含量测定 取静脉注射人免疫球蛋白供试 品 5批 , 按本文方法进行测定 , 计算供试品中 I gG 的 含量 , 结果见表 6。表 6 含量测定结果 (n =2批号I gG 含量 (mg/ml 20090941340. 720090941441. 320090971643. 320090971942.

21、42009101039. 53 讨论3. 1 曲线比较 从 3种方法的线性试验及各自的915 解放军药学学报 2010年 12月 20日 第 26卷 第 6期 Phar m J Chin PLA, VO l . 26, NO. 6, D ece m ber 20, 2010标准曲线可知 , 在一定浓度范围内高效亲和色谱法 的相关线性优于紫外分光光度法及酶联免疫法 。 紫 外法中 , 将吸收值与 I gG 浓度直接进行线性回归时 , 未能显出良好正相关性 , 参照文献进行双对数回归 后方显良好的线性 。3. 2 回收率比较 从表 1和表 4可知 , 高效亲和色 谱法的回收率结果优于紫外分光光度法

22、 。3. 3 测定结果比较 从 3种方法的测定结果可知 , 紫外法的测定值高于高效亲和色谱法和酶联免疫 法 。 将高效亲和色谱法的测定结果与紫外法测定结 果进行线性相关分析 , 其线性方程与相关系数分别 为 : Y =0. 9375X -7. 525, R 2=0. 9849 高效亲和色谱法对酶联免疫法 , 其线性方程与 相关系数分别为 : Y =1. 2265X -8. 4778, R 2=0. 9911 高效亲和色谱法与紫外法和酶联免疫法的测定 值之间呈正相关性 。 对 3种方法的测定结果分别进 t 检验分析 果见表 7。表 7t方法 Sig (双尾 UV 2HP AC 40. 000 U

23、V 2EL I S A 13. 76740. 000 HP AC 2EL I S A 0. 87140. 409 由表 7可以看出 UV 法和 HP AC 法及 EL I S A 法 测定结果的显著性差异 (P <0. 05 , HP AC 法与 EL I S A 法测定结果无显著性差异 (P >0. 05 。 高效液相亲和色谱法测定 IgG 是在特定条件 下 , I gG 能被吸附于其配基上 , 并利用洗脱液将其 洗脱进行定量分析 ; 紫外分光光度法是利用 I gG 在 37 能抗人 IgG 发生抗原 2抗 体反应 , 从而利用标 准品来对供试品 I gG 进行定量 ; 酶联免疫

24、分析法是 用纯化的抗 2IgG 抗体包被微孔板 , 制成固相抗体 , 在微孔中依次加入 I gG 、 HRP 标记的羊抗人抗体结 合 , 形成抗体 2抗 原 2酶 标抗体复合物 , 经过彻底洗 涤后加底物 T MB 显色 , 利用酶标仪测定吸收值 , 通 过标准曲线来定量供试品中 I gG 的含量 528。 高效亲和色谱法精密度好 , 操作也较简便 ; 紫 外分光光度法的重复性不如高效亲和色谱法好 , 且需同时做几个不同稀释度进行实验 , 操作相对 较繁琐 , 且据该法测定原理可知 , 紫外分光光度法 是从测定反应液的浊度衍生而得 , 因此紫外分光 光度法的专属性不如另外两种方法 ; 酶联免疫分 析法的缺点在于费用较高 。含量测定结果显示 , 高效亲和色谱法和酶联免疫分析法与紫外分光光 度法相比较有显著性差异 , 但高效亲和色谱法和 酶联免疫分析法并无显著性差异 。 3种方法的测 定结果显正相关性 , 其中高效亲和色谱法操作