第二章蛋白质化学3-蛋白质结构与功能的关系2

1、2022-1-21 生物化学生物化学Biochemistry第二章 蛋白质protein第五节第五节蛋白质结构与功能的关系蛋白质结构与功能的关系（The Relation of Structure and Function of Protein）（一）一级结构是空间构象的基础（一）一级结构是空间构象的基础 一、蛋白质一级结构与功能的关系一、蛋白质一级结构与功能的关系 牛胰核糖核酸牛胰核糖核酸酶的一级结构酶的一级结构二二硫硫键键 天然状态，天然状态，有催化活性有催化活性 尿素、尿素、 -巯基乙醇巯基乙醇 去除尿素、去除尿素、-巯基乙醇巯基乙醇非折叠状态，无活性非折叠状态，无活性v多肽链中氨基酸的

2、排列顺序决定了多肽链中氨基酸的排列顺序决定了肽链的折叠和卷曲方式肽链的折叠和卷曲方式v部分氨基酸残基在蛋白质空间结构中部分氨基酸残基在蛋白质空间结构中处于关键位置处于关键位置1、种属差异、种属差异同源蛋白同源蛋白（homologous protein) 在不同生物体中行使相同或相似功在不同生物体中行使相同或相似功能的蛋白质。能的蛋白质。同源蛋白质的氨基酸顺同源蛋白质的氨基酸顺序具有明显的相似性即为序列同源。序具有明显的相似性即为序列同源。 （二）一级结构与功能的关系（二）一级结构与功能的关系 如不同哺乳动物的胰岛素如不同哺乳动物的胰岛素分子结构都由分子结构都由A A和和B B两条两条链组成，且

3、二硫键的配对和空间构象极其相似。链组成，且二硫键的配对和空间构象极其相似。一级结构也相似，仅有个别氨基酸有差异，因此一级结构也相似，仅有个别氨基酸有差异，因此它们都执行着相同的它们都执行着相同的调节糖代谢调节糖代谢的生理功能。的生理功能。同源蛋白的一级结构中有许多位置的氨基酸对所同源蛋白的一级结构中有许多位置的氨基酸对所有种属来说都是相同的，称为有种属来说都是相同的，称为不变残基不变残基（invariant residue） 。其他位置的氨基酸差。其他位置的氨基酸差异较大，称为异较大，称为可变残基可变残基（variable residue） 。哺乳动物胰岛素氨基酸序列差异哺乳动物胰岛素氨基酸序

4、列差异胰岛素胰岛素人人猪猪狗狗兔兔牛牛羊羊马马 氨基酸残基序列号氨基酸残基序列号A5ThrThrThrThrAlaAlaThrA6Ser SerSerGlyGlySerSerA10 Ile Ile Ile IleValValIleB30ThrAlaAlaSerAlaAlaAla 是一种与血红素辅基共价结合的单链蛋白，是一种与血红素辅基共价结合的单链蛋白，存在于真核生物线粒体中。相对分子量约为存在于真核生物线粒体中。相对分子量约为13,00013,000，含有，含有104104个氨基酸残基。近个氨基酸残基。近100100个种属个种属的细胞色素的细胞色素c c氨基酸顺序已被测定。氨基酸顺序已被测定

5、。肽链中肽链中2828个位置的氨基酸个位置的氨基酸对所有已测试的种属都相同的，对所有已测试的种属都相同的，表明，这些残基是规定细胞色素表明，这些残基是规定细胞色素c c功能所必需功能所必需的。的。细胞色素细胞色素c（cytochrome c, Cyt.c）生物名称生物名称与人不同的氨与人不同的氨基酸参加数目基酸参加数目生物名称生物名称与人不同的氨与人不同的氨基酸参加数目基酸参加数目黑猩猩黑猩猩0响尾蛇响尾蛇14恒河猴恒河猴1海龟海龟15兔兔9金枪鱼金枪鱼21袋鼠袋鼠10角鲛角鲛23牛、猪、羊牛、猪、羊10小蝇小蝇25狗狗11蛾蛾31驴驴11小麦小麦35马马12粗糙链孢菌粗糙链孢菌43鸡、火鸡鸡

6、、火鸡13酵母菌酵母菌44不同生物与人细胞色素不同生物与人细胞色素c的氨基酸数目比较的氨基酸数目比较 狗狗人人猴猴 马马骡骡 鲸鲸 兔兔猪猪袋鼠袋鼠企鹅企鹅鸡鸡 鸭鸭响尾蛇响尾蛇龟龟苍蝇苍蝇 蛾蛾脉孢菌属脉孢菌属念珠菌属念珠菌属面包酵母菌面包酵母菌小麦小麦牛牛 蛙蛙金枪鱼金枪鱼动动 物物爬行动物爬行动物两栖动物两栖动物鱼鱼哺乳动物哺乳动物鸟鸟昆昆 虫虫植植 物物脊椎动物脊椎动物从细胞色素从细胞色素C的一级结构看生物进化的一级结构看生物进化生物进化生物进化2、一级结构改变引起分子病、一级结构改变引起分子病 例：镰刀形红细胞贫血例：镰刀形红细胞贫血N-val his leu thr pro glu

7、 glu C(146) HbS 肽链肽链HbA 肽肽 链链N-val his leu thr pro val glu C(146) 基因突变导致蛋白质一级结构的突变，导致基因突变导致蛋白质一级结构的突变，导致蛋白质生物功能的下降或丧失，这种由蛋白质蛋白质生物功能的下降或丧失，这种由蛋白质分子发生变异所导致的疾病，分子发生变异所导致的疾病，称为称为“分子病分子病（molecular disease）” 。 最早从分子水平最早从分子水平证明的先天性遗传证明的先天性遗传病病镰刀形红细镰刀形红细胞贫血症胞贫血症( (sickle-cell anemia) )。镰刀形红细胞镰刀形红细胞正常血细胞正常血细

8、胞hemoglobin 6: GAA(Glu) - GTA(Val) 血红蛋白 -链上谷氨酸变成缬氨酸镰刀状贫血病 的分子机理3、蛋白质前体的激活、蛋白质前体的激活 一些蛋白质或酶在细一些蛋白质或酶在细胞中首先合成的是其前胞中首先合成的是其前体体,在成为有功能的蛋白在成为有功能的蛋白质或酶之前需要激活质或酶之前需要激活. 例如例如,胰岛素胰岛素(insulin ).的前体是胰岛素原的前体是胰岛素原(proinsulin),要在切除要在切除C肽之后才转变为活性的肽之后才转变为活性的胰岛素胰岛素胰岛素原的一级结构胰岛素原的一级结构一级结构差异越小，功能相关性越大。一级结构差异越小，功能相关性越大。

9、一级结构上的细微变化可直接影响其功能一级结构上的细微变化可直接影响其功能（一）血红蛋白与肌红蛋白的结构（一）血红蛋白与肌红蛋白的结构 二、蛋白质空间结构与功能的关系二、蛋白质空间结构与功能的关系 1 1、血红素、血红素 肌红蛋白肌红蛋白(myoglobin,Mb)与与血红蛋白都是含有血红蛋白都是含有血红素血红素辅辅基的蛋白质。血红素是铁卟基的蛋白质。血红素是铁卟啉化合物，由啉化合物，由4个甲炔基相连个甲炔基相连成为一个环形，成为一个环形，Fe2+居于环中。居于环中。铁离子有铁离子有6个配位键，其中个配位键，其中4个与吡咯环的个与吡咯环的N配位结合，配位结合，1个配位键和肌红蛋白的个配位键和肌红

10、蛋白的93位位组氨酸残基结合，氧则与组氨酸残基结合，氧则与Fe2+ 形成第形成第6个配位键，接近第个配位键，接近第64位（位（E7)组氨酸组氨酸。肌红蛋白（肌红蛋白（myoglobin, Mb） 肌红蛋白是一个肌红蛋白是一个只有三级只有三级结构结构的蛋白质，有的蛋白质，有8段段-螺螺旋结构，旋结构，分别成为分别成为A B C D E F G H肽段。整条多肽链折肽段。整条多肽链折叠成紧密球状分子，氨基酸叠成紧密球状分子，氨基酸残基上的疏水侧链大都在分残基上的疏水侧链大都在分子内部，富极性及电荷的则子内部，富极性及电荷的则在分子表面，因此水溶性较在分子表面，因此水溶性较好。好。Mb分子内部有个袋

11、形分子内部有个袋形空穴，血红素居于其中。空穴，血红素居于其中。血红蛋白（血红蛋白（hemoglobin, Hb） 血红蛋白具有四个亚基血红蛋白具有四个亚基组成的四级结构，每个亚基组成的四级结构，每个亚基中间有一个疏水局部，可携中间有一个疏水局部，可携带一个血红素并携带一分子带一个血红素并携带一分子氧，氧，因此因此1分子分子Hb共结合四共结合四分子氧分子氧。Hb各亚基的三级结各亚基的三级结构与构与Mb极为相似。极为相似。Hb亚基亚基之间通过八对盐键，使四个之间通过八对盐键，使四个亚基紧密结合而形成亲水的亚基紧密结合而形成亲水的球状蛋白。球状蛋白。Hb与与Mb一样能可逆地与一样能可逆地与O2结合，

12、结合， Hb与与O2结合后称为氧合结合后称为氧合Hb。氧合。氧合Hb占总占总Hb的百分数（称百分饱和度）随的百分数（称百分饱和度）随O2浓度变化而改变。浓度变化而改变。2、血红蛋白的构象变化与结合氧、血红蛋白的构象变化与结合氧 * 协同效应协同效应(cooperativity) 一个寡聚体蛋白质的一个亚基与其配体结合一个寡聚体蛋白质的一个亚基与其配体结合后，能影响此寡聚体中另一个亚基与配体结合能后，能影响此寡聚体中另一个亚基与配体结合能力的现象，称为力的现象，称为协同效应协同效应。 如果是促进作用则称为如果是促进作用则称为正协同效应正协同效应 (positive cooperativity)如

13、果是抑制作用则称为如果是抑制作用则称为负协同效应负协同效应 (negative cooperativity)抗体抗体生物体内最奇妙的分子生物体内最奇妙的分子 无限的多样性（无限的多样性（diversity) 功能与结构的双重性功能与结构的双重性 可变区可变区抗原结合抗原结合 恒定区恒定区生物学效应功能生物学效应功能（二）免疫球蛋白的结构与功能（二）免疫球蛋白的结构与功能（1）抗体的基本结构）抗体的基本结构Ig分子基本结分子基本结构是由四个肽构是由四个肽链组成的。链组成的。包括二条较小包括二条较小的轻链和二条的轻链和二条较大的重链。较大的重链。轻链与重链之轻链与重链之间是由二硫键间是由二硫键连接

14、形成连接形成Ig分分子单体。子单体。 （1）抗体的基本结构）抗体的基本结构（2）可变区和恒定区）可变区和恒定区 可变区可变区和抗原识别有关，决定抗体识别的特异性，和抗原识别有关，决定抗体识别的特异性，而而恒定区恒定区和效应功能相关。和效应功能相关。 此外在此外在Y形分子伸出的两臂和主干之间还有个可形分子伸出的两臂和主干之间还有个可弯曲的弯曲的铰链区铰链区(hinge R)，能改变两个结合抗原的，能改变两个结合抗原的Y形臂之间的距离。形臂之间的距离。 两臂之间的角度可有自两臂之间的角度可有自0到到90的变化，这样的变化，这样有利于两臂同时结合位于抗原上分布于不同位置有利于两臂同时结合位于抗原上分

15、布于不同位置的表位。的表位。铰链区Ig的铰链区及其功能（三）蛋白质构象改变与疾病（三）蛋白质构象改变与疾病 蛋白质构象疾病：蛋白质构象疾病：若蛋白质的折叠若蛋白质的折叠发生错误，尽管其一级结构不变，但蛋发生错误，尽管其一级结构不变，但蛋白质的构象发生改变，仍可影响其功能，白质的构象发生改变，仍可影响其功能，严重时可导致疾病发生。严重时可导致疾病发生。蛋白质构象改变导致疾病的机理：蛋白质构象改变导致疾病的机理：有些蛋有些蛋白质错误折叠后相互聚集，常形成抗蛋白水解白质错误折叠后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病，表现酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病，表现为蛋白质淀粉样纤

16、维沉淀的病理改变。为蛋白质淀粉样纤维沉淀的病理改变。这类疾病包括：这类疾病包括：人纹状体脊髓变性病、老人纹状体脊髓变性病、老年痴呆症、亨停顿舞蹈病、疯牛病等。年痴呆症、亨停顿舞蹈病、疯牛病等。疯牛病中的蛋白质构象改变疯牛病中的蛋白质构象改变疯牛病是由朊病毒蛋白疯牛病是由朊病毒蛋白(prion protein, PrP)引起的一组人和动物神经退行性病变。引起的一组人和动物神经退行性病变。正常的正常的PrP富含富含-螺旋，称为螺旋，称为PrPc。PrPc在某种未知蛋白质的作用下可转变成全在某种未知蛋白质的作用下可转变成全为为-折叠的折叠的PrPsc，从而致病。，从而致病。PrPc-螺旋螺旋PrPs

17、c-折叠折叠正常正常疯牛病疯牛病第六节第六节蛋白质的性质与分离、分析技术蛋白质的性质与分离、分析技术一、蛋白质的性质一、蛋白质的性质 相对分子质量很大，一般介于相对分子质量很大，一般介于10 000-1 000 000道尔顿道尔顿之间，也有更大的。之间，也有更大的。 测定分子量的方法很多：测定分子量的方法很多：渗透压法、超离心法、渗透压法、超离心法、凝胶过滤法、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。凝胶过滤法、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。（一）蛋白质相对分子质量（一）蛋白质相对分子质量（二）蛋白质的两性性质及等电点（二）蛋白质的两性性质及等电点蛋白质分子除蛋白质分子除两端的氨基和羧基两端的氨基和羧基可解离外，可解离

18、外，氨基酸残基侧链中某些基团氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液，在一定的溶液pHpH条条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。 蛋白质的等电点蛋白质的等电点( isoelectric point, pI) 当蛋白质溶液处于某一当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的荷为零，此时溶液的pH称为称为蛋白质的等电点。蛋白质的等电点。 各种蛋白质有特定的等电点，和它所含的氨基各种蛋白质有特定的等电点，和它所含的氨基酸种类和数量有关。酸种类和数量

19、有关。 例：含有碱性氨基酸较多，则例：含有碱性氨基酸较多，则pI偏碱（偏大）偏碱（偏大） 含有酸性氨基酸较多，则含有酸性氨基酸较多，则pI偏酸（偏小）；偏酸（偏小）； 含有酸、碱氨基酸数目相近时，含有酸、碱氨基酸数目相近时，pI为中性偏为中性偏酸，约为酸，约为5.0左右。左右。 pHpI，蛋白质带负电蛋白质带负电，体内蛋白质的，体内蛋白质的pI大多大多为为5.0左右，故生理条件下一般以左右，故生理条件下一般以负离子负离子形式存在。形式存在。 蛋白质蛋白质 酸性氨基酸数酸性氨基酸数 碱性氨基酸数碱性氨基酸数 pIpI胃蛋白酶胃蛋白酶 37 6 1.037 6 1.0胰岛素胰岛素 4 4 5.35

20、4 4 5.35RNARNA酶酶 10 18 7.8 10 18 7.8细胞色素细胞色素c 12 25 9.8c 12 25 9.810.810.8等电点时，蛋白质以两性离子存在，最不稳定，等电点时，蛋白质以两性离子存在，最不稳定，溶解溶解度最小，易沉淀析出度最小，易沉淀析出（用于蛋白质的分离提纯）；蛋（用于蛋白质的分离提纯）；蛋白质的粘度、渗透压、膨胀性以及导电能力均最小。白质的粘度、渗透压、膨胀性以及导电能力均最小。（三）蛋白质的变性与复性（三）蛋白质的变性与复性 * 蛋白质的变性蛋白质的变性(denaturation)在某些物理和化学因素作用下，其特定在某些物理和化学因素作用下，其特定的

21、的空间构象被破坏空间构象被破坏（即有序的空间结构变成（即有序的空间结构变成无序的空间结构），从而导致其无序的空间结构），从而导致其理化性质改理化性质改变和生物活性的丧失变和生物活性的丧失。造成变性的因素造成变性的因素物理因素：物理因素：加热、紫外线、加热、紫外线、X线、超声波线、超声波化学因素：化学因素：乙醇等有机溶剂、强酸、强乙醇等有机溶剂、强酸、强 碱、重金属离子及生物碱试剂等碱、重金属离子及生物碱试剂等 。 变性的本质变性的本质 破坏非共价键和二硫键，破坏非共价键和二硫键，不改变蛋白不改变蛋白质的一级结构。质的一级结构。 变性特征：变性特征： 生物活性丧失；生物活性丧失； 理化性质改变：

22、理化性质改变：溶解度降低、球状蛋白质的溶解度降低、球状蛋白质的不对称性增加、粘度增加、扩散系数降低，某不对称性增加、粘度增加、扩散系数降低，某些蛋白质不能够再形成结晶些蛋白质不能够再形成结晶, , 变性后分子结构变性后分子结构松散、易被水解，变性蛋白易被酶消化。松散、易被水解，变性蛋白易被酶消化。 组成和相对分子质量不变组成和相对分子质量不变若蛋白质变性程度较轻，去除变性若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后，蛋白质仍可恢复或部分恢复其因素后，蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有的构象和功能，称为原有的构象和功能，称为复性复性。蛋白质的复性蛋白质的复性(renaturation) Anfinsen实验

23、实验-牛胰核糖核酸酶的变性和复性牛胰核糖核酸酶的变性和复性结论：结论：蛋白质的变性是可逆的；一级结构决定三蛋白质的变性是可逆的；一级结构决定三维结构；形成三维结构所需要的所有信息都包含维结构；形成三维结构所需要的所有信息都包含在一级结构中。在一级结构中。（四）蛋白质的胶体性质（四）蛋白质的胶体性质 蛋白质属于生物大分子之一，分子量可自蛋白质属于生物大分子之一，分子量可自1万至万至100万之巨，其分子的直径可达万之巨，其分子的直径可达1100nm，为胶粒范围之内。，为胶粒范围之内。 * * 蛋白质胶体稳定的因素蛋白质胶体稳定的因素颗粒表面电荷颗粒表面电荷水化膜水化膜+带正电荷的蛋白质带正电荷的蛋

24、白质带负电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质在等电点的蛋白质在等电点的蛋白质水化膜水化膜+带正电荷的蛋白质带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质不稳定的蛋白质颗粒不稳定的蛋白质颗粒酸酸碱碱酸酸碱碱酸酸碱碱脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用溶液中蛋白质的聚沉溶液中蛋白质的聚沉蛋白质由于带有蛋白质由于带有电荷和水膜电荷和水膜，因此在水溶液，因此在水溶液中能成为稳定的胶体。如果在蛋白质溶液中加入中能成为稳定的胶体。如果在蛋白质溶液中加入某种电解质或调节溶液某种电解质或调节溶液pHpH，破坏了蛋白质的水化，破坏了蛋白质的水化膜及中和了蛋白质的电荷，则蛋白质从溶液中析膜及中和了蛋白质的电

25、荷，则蛋白质从溶液中析出的作用，称为蛋白质的沉淀作用。出的作用，称为蛋白质的沉淀作用。变性的蛋白质易于沉淀，有时蛋白质发生沉变性的蛋白质易于沉淀，有时蛋白质发生沉淀，但并不变性。淀，但并不变性。 根据反应的可逆性分为根据反应的可逆性分为可逆沉淀可逆沉淀和和不可逆沉不可逆沉淀淀两种。两种。（五）蛋白质的沉淀反应（五）蛋白质的沉淀反应1、可逆的沉淀作用、可逆的沉淀作用 定义：定义：蛋白质发生沉淀后，用透析等方法除去沉蛋白质发生沉淀后，用透析等方法除去沉淀剂，可使蛋白质重新溶于原来的溶液中。淀剂，可使蛋白质重新溶于原来的溶液中。 在沉淀过程中，在沉淀过程中，结构和性质都没有发生变化，结构和性质都没有

26、发生变化，在在适当的条件下，可以重新溶解形成溶液，所以这适当的条件下，可以重新溶解形成溶液，所以这种沉淀又称为种沉淀又称为非变性沉淀非变性沉淀。 可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方法，可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方法，如如等等电点沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法电点沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等。等。反应类型：反应类型： （1）加高浓度盐类）加高浓度盐类 : 如硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等如硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等 盐析：盐析：加盐使蛋白质沉淀析出的现象加盐使蛋白质沉淀析出的现象 不同的蛋白质盐析时所需的盐浓度不同，调节不同的蛋白质盐析时所需的盐浓度不同，调节盐浓度可将混合蛋白质分段析出（分段

27、盐析）。盐浓度可将混合蛋白质分段析出（分段盐析）。例：例： 半饱和的半饱和的(NH4)2SO4可使球蛋白沉淀；可使球蛋白沉淀； 饱和的饱和的(NH4)2SO4可使清蛋白析出。可使清蛋白析出。 应用：应用：利用此性质可分离和制备各种蛋白质和利用此性质可分离和制备各种蛋白质和酶制品酶制品（2）加有机溶剂：）加有机溶剂：如酒精、丙酮等如酒精、丙酮等机理：机理：有机溶剂和水有较强的作用，破坏有机溶剂和水有较强的作用，破坏了蛋白质分子周围的水膜，因此发生沉淀反应。了蛋白质分子周围的水膜，因此发生沉淀反应。（3）等电点沉淀）等电点沉淀 利用蛋白质的两性性质，在等电点时溶解度利用蛋白质的两性性质，在等电点时

28、溶解度最小的特点。最小的特点。 在在pI时，加入这些有机溶剂可加速蛋白质的时，加入这些有机溶剂可加速蛋白质的沉淀，可用于蛋白质的分离纯化。沉淀，可用于蛋白质的分离纯化。 定义：定义：蛋白质发生沉淀后，不能用透析等方法除蛋白质发生沉淀后，不能用透析等方法除去沉淀剂而使蛋白质重新溶解的现象去沉淀剂而使蛋白质重新溶解的现象 在强烈沉淀条件下，不仅在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性，的稳定性，而且也而且也破坏了蛋白质的结构和性质，破坏了蛋白质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水。产生的蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水。 由于沉淀过程发生了由于沉淀过程发生

29、了蛋白质的结构和性质的变化蛋白质的结构和性质的变化，所以又称为变性沉淀。所以又称为变性沉淀。 如如加热沉淀、强酸碱沉淀、重金属盐沉淀和生物加热沉淀、强酸碱沉淀、重金属盐沉淀和生物碱沉淀等碱沉淀等都属于不可逆沉淀。都属于不可逆沉淀。2、不可逆沉淀、不可逆沉淀（六）蛋白质的颜色反应（六）蛋白质的颜色反应1、双缩脲反应、双缩脲反应(biuret reaction)蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与硫蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热，呈现紫色或红色，此反应称为酸铜共热，呈现紫色或红色，此反应称为双缩脲双缩脲反应反应，双缩脲反应可用来检测蛋白质水解程度。，双缩脲反应可用来检测蛋白质水解程

30、度。2、米伦氏反应（酚基）、米伦氏反应（酚基） 米伦试剂为米伦试剂为硝酸汞、亚硝酸汞、硝酸和亚硝硝酸汞、亚硝酸汞、硝酸和亚硝酸的混合物酸的混合物，蛋白质溶液加入此试剂后即产生，蛋白质溶液加入此试剂后即产生白色白色沉淀沉淀，加热后沉淀变为，加热后沉淀变为红色红色。酪氨酸含有酚基，故。酪氨酸含有酚基，故含酪氨酸的蛋白质都有此反应。含酪氨酸的蛋白质都有此反应。3、乙醛酸反应（吲哚基）、乙醛酸反应（吲哚基） 在蛋白质溶液中加入在蛋白质溶液中加入乙醛酸乙醛酸，并沿试管壁慢慢，并沿试管壁慢慢注入浓硫酸，在两层之间就会出现注入浓硫酸，在两层之间就会出现紫色环紫色环。色氨酸。色氨酸及含有色氨酸的蛋白质有此反应

31、。及含有色氨酸的蛋白质有此反应。4、坂口反应、坂口反应 精氨酸分子含有精氨酸分子含有胍基胍基，能与次氯酸钠及，能与次氯酸钠及- -萘萘酚在氢氧化钠溶液中产生酚在氢氧化钠溶液中产生红色产物红色产物。5 5、酚试剂（福林试剂）反应、酚试剂（福林试剂）反应 酪氨酸中的酚基能将福林试剂中的磷钼酸及磷酪氨酸中的酚基能将福林试剂中的磷钼酸及磷钨酸还原成蓝色化合物。钨酸还原成蓝色化合物。 该反应常用蛋白质的定量测定。该反应常用蛋白质的定量测定。（五）蛋白质的紫外吸收（五）蛋白质的紫外吸收由于蛋白质分子中含有由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸共轭双键的酪氨酸和色氨酸和色氨酸，因此在，因此在280nm波长波长

32、处有特征性吸收处有特征性吸收峰。蛋白质的峰。蛋白质的OD280与其浓度呈正比关系，因与其浓度呈正比关系，因此可作此可作蛋白质定量测定蛋白质定量测定。 前处理及抽提：前处理及抽提：选材、破碎、匀浆、溶解、离心或选材、破碎、匀浆、溶解、离心或差速离心、（差速离心、（pH、温度、酶的抑制剂等保证蛋白质、温度、酶的抑制剂等保证蛋白质的稳定）。的稳定）。 粗制品获得（粗分级分离）：粗制品获得（粗分级分离）：盐析、等电点沉淀、盐析、等电点沉淀、有机溶剂分级分离，离心。有机溶剂分级分离，离心。 纯化（细分级分离）：纯化（细分级分离）：层折法。层折法。 鉴定和测定：鉴定和测定：纯度和含量。纯度和含量。二、蛋白

33、质的分离和分析技术二、蛋白质的分离和分析技术（一）蛋白质分离纯化的一般原则（一）蛋白质分离纯化的一般原则1 1、透析及超滤、透析及超滤* 透析透析(dialysis)利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。开的方法。只用于除盐类和小分子杂质只用于除盐类和小分子杂质（二）常见分离纯化技术（二）常见分离纯化技术透析透析(dialysis):磁力搅拌器磁力搅拌器透析前透析前透析后透析后透析袋透析袋通过透析，小分子通过透析袋，散布于透析液通过透析，小分子通过透析袋，散布于透析液中，大分子量的蛋白质不能通过透析袋，留在透析中，大分子量的蛋白质不能通过透析

34、袋，留在透析袋内。从而，蛋白质溶液中的小分子物质通过透析袋内。从而，蛋白质溶液中的小分子物质通过透析被分离除去。被分离除去。超过滤超过滤（ultrafiltration）加压加压蛋白质溶液蛋白质溶液半透膜半透膜支持膜的栅板支持膜的栅板超滤液超滤液原理原理: :是利用压是利用压力或离心力，强力或离心力，强行使水和其他小行使水和其他小分子溶质通过半分子溶质通过半透膜，而蛋白质透膜，而蛋白质留在半透膜上，留在半透膜上，以达到浓缩和脱以达到浓缩和脱盐的目的盐的目的2 2、盐析和盐溶、盐析和盐溶*盐析盐析(salt precipitation)：将高浓度的中性盐，：将高浓度的中性盐，如硫酸铵、硫酸钠或氯

35、化钠等加入蛋白质溶如硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面液，使蛋白质表面电荷电荷被中和以及被中和以及水化膜水化膜被被破坏，导致蛋白质沉淀。破坏，导致蛋白质沉淀。 盐溶（盐溶（salt solution）：）：低浓度的中性盐可以使低浓度的中性盐可以使蛋白质溶解度增加。蛋白质溶解度增加。 等电点沉淀法：等电点沉淀法：不同蛋白质、氨基酸组成不同，不同蛋白质、氨基酸组成不同，等电点不同，可利用等电点沉淀方法进行分离。等电点不同，可利用等电点沉淀方法进行分离。 等电点特点：等电点特点：蛋白溶解度最低蛋白溶解度最低3 3、等电点沉淀法、等电点沉淀法4 4、低温有机溶剂沉淀法、低温有机溶剂沉

36、淀法*常用有机溶剂：常用有机溶剂：乙醇、丙酮乙醇、丙酮*丙酮沉淀：丙酮沉淀：使用使用丙酮沉淀丙酮沉淀时，必须在时，必须在04低温低温下进行，丙酮用量一般下进行，丙酮用量一般10倍于蛋白质溶液体积。倍于蛋白质溶液体积。蛋白质被丙酮沉淀后，应立即分离，否则蛋白易蛋白质被丙酮沉淀后，应立即分离，否则蛋白易变性。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。变性。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。 以上几种方法只能分离得到蛋白质的粗制品，以上几种方法只能分离得到蛋白质的粗制品，还无法得到具有一定纯度的蛋白质。还无法得到具有一定纯度的蛋白质。5 5、电泳、电泳根据电荷不同进行纯化的方法根据电荷不同进行纯化的方法蛋白质在高于

37、或低于其蛋白质在高于或低于其pI的溶液中为带电的的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种通过颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术术, 称为称为电泳电泳(elctrophoresis) 。根据支撑物的不同，可分为根据支撑物的不同，可分为薄膜电泳、凝胶薄膜电泳、凝胶电泳电泳等。等。 原点原点带负电荷蛋白质的泳动方向带负电荷蛋白质的泳动方向滤纸、醋酸纤维素滤纸、醋酸纤维素薄膜或其他支持物薄膜或其他支持物阳阳极极阴极阴极电极缓冲液电极缓冲液电极缓冲液电极缓冲液电泳示意图电泳示意图薄膜电泳薄膜电泳几

38、种重要的蛋白质电泳几种重要的蛋白质电泳*SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于蛋白质分常用于蛋白质分子量的测定。子量的测定。*等电聚焦电泳，等电聚焦电泳，通过蛋白质等电点的差异而分通过蛋白质等电点的差异而分离蛋白质的电泳方法。离蛋白质的电泳方法。*双向凝胶电泳，双向凝胶电泳，以上两种方法相结合，是蛋白以上两种方法相结合，是蛋白质组学研究的重要技术。质组学研究的重要技术。凝胶电泳凝胶电泳（四）层析（色谱）（四）层析（色谱）层析层析(chromatography)分离蛋白质的原理分离蛋白质的原理当流动相带着待分离蛋白质溶液经过一个固当流动相带着待分离蛋白质溶液经过一个固态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋白态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分离的质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同速度流蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的经固定相而达到分离蛋白质的目的 。蛋白质分离常用的层析方法蛋白质分离常用的层析方法* 离子交换层析：离子交换层析：利用各蛋白质的电荷量及性质利用各蛋白质的电荷量及性质不同进行分离。不同进行分离。 凝胶过滤凝胶过滤(gel filtration)又称分子筛层析、分子又称分子筛