消臌软坚丸对肝硬化大鼠肝组织病理学和表皮生长因子的影响

1、消臌软坚丸对肝硬化大鼠肝组织病理学和表皮生长因子的影响        【摘要】     目的 观察消臌软坚丸对肝硬化大鼠肝组织病理学和表皮生长因子(EGF)的影响。方法 采用四氯化碳复合因素造模法复制肝硬化大鼠模型,随机分组处理：正常组和模型组灌服生理盐水,消臌软坚丸低、高剂量组每日分别灌胃消臌软坚丸混悬液1.6 g/kg体重和3.2 g/kg体重,阳性药对照组每日灌胃复方鳖甲软肝片混悬液0.6 g/kg体重,共4周。光镜下观察肝硬化大鼠肝组织病理形态学变化；并测定

2、血清和肝组织EGF含量。结果 与正常组比较,模型组大鼠肝间质广泛纤维组织增生,将正常肝小叶分割成大小不等的肝细胞团(即假小叶形成),血清和肝组织EGF含量明显升高(P0.01)。与模型组比较, 消臌软坚丸高、低剂量组和阳性药对照组肝小叶结构亦受损,少量纤维组织增生,但未见形成间隔。血清和肝组织EGF含量明显下降(P0.05或P0.01)。其中高剂量组与阳性药对照组比较差异有统计学意义(P0.05)。结论 消臌软坚丸能显著改善肝硬化大鼠的肝脏病理组织学损害,同时可降低血清和肝组织EGF水平,具有显著的抗肝脏纤维化、阻断肝硬化进程的作用,对腹水的产生与消退也产生积极的影响。   

3、;  【关键词】  消臌软坚丸；肝硬化；病理形态学；表皮生长因子；大鼠    Effect of Xiaogu Ruanjian Pills on Hepatic Histopathology and Epidermal Growth Factor of Hepatic Cirrhosis Rats QI Zhong-xi, GENG Lan-shu, GENG Shu-hua, et alHebei Hepatopathy Hospital of TCM, Zhengding 050800, China 

4、;   Abstract：Objective To observe the effect of Xiaogu Ruanjian pills on hepatic histopathology and epidermal growth factor (EGF) of liver cirrhosis rats. Methods The rats model of cirrhosis was made by complex factors, compared with Fufang Biejia Ruanganpian, the effect of Xiaogu Ruanjian

5、 Pills on hepatic pathology and EGF were observed. Results Compared with the normal group, extensive fibrous tissue hyperplasia can be seen in hepatic mesenchyme of the model group, the liver pseudolobule formed, and the contents of EGF in serum and liver were increased (P0.01). Compared with the mo

6、del group, there were a few fibrous tissue hyperplasia in high-dosage group, low-dosage group and control group, no fibrotic septa formed, and he contents of EGF in serum and liver were decreased (P0.01 or P0.05). There was significant difference between high-dosage group and control group (P0.05).

7、Conclusion Xiaogu Ruanjian pills can obviously improve the cirrhosis rat pathology, decrease the contents of EGF in serum and liver, decrease or restrain the happening or development of ascites.    Key words：Xiaogu Ruanjian Pills；hepatic cirrhosis；histopathology；epidermal growth facto

8、r；rat    肝硬化是临床常见的慢性进行性肝脏疾病,是由一种或多种病因长期或反复作用造成的弥散性肝脏损害,肝硬化腹水是肝硬化门脉高压征的主要临床表现。在肝硬化性疾病中,表皮生长因子(EGF)表达上调是一主要特征,它除了刺激肝细胞和胆管上皮细胞增生外,还具有促进肝星形细胞(HSC)分裂增生的能力。消臌软坚丸是本院治疗肝硬化腹水的制剂,临床研究显示对腹水具有良好效果1。本实验采用复合因素造模法复制肝硬化大鼠模型,观察其对肝硬化大鼠肝组织病理学和EGF的影响,以揭示其延缓肝硬化进程,探讨治疗肝硬化腹水的作用机理。1  实验材料1.1  动物

9、60;   健康SD大鼠60只,体重(180±20)g,雌雄各半,由河南省安阳华兴实验动物养殖场提供,动物合格证号：SCXK(鄂)2004- 0007。1.2 药物    消臌软坚丸由河北中医肝病医院制剂室制备(由黄芪30 g、车前子30 g、葶苈子15 g、沉香6 g、鳖甲30 g等组成,课题组监制),实验时用蒸馏水将其配制成所需浓度的混悬液。复方鳖甲软肝片(阳性对照药),内蒙古福瑞制药有限责任公司提供,国药准字(2005)Z-71号,实验时用蒸馏水将其配制成所需浓度的混悬液。1.3 主要试剂    E

10、GF试剂盒,批号20051202,购自北京中生生物工程高技术公司。1.4  主要仪器    722型光栅分光光度计,上海第三分析仪器厂；1-15K型高速冷冻离心机,美国Sigma公司；HH-W21-600型电热恒温水箱,天津泰斯特仪器有限公司；LEICA RM2125型切片机,德国LEICA公司；TDL-5-A型离心机,上海安亭科学仪器厂。2  实验方法2.1  造模    60只大鼠适应性喂养1周,随机分为造模组48只和正常组12只。参照文献2,48只造模组大鼠首次予以皮下注射40%四氯化碳(CCl4)

11、花生油溶液0.5 mL/100 g体重,以后每周2次皮下注射0.3 mL/100 g体重,共9周。造模开始前2周均以20%猪油、0.5%胆固醇、79.5%玉米面混合饲料(河北医科大学动物实验中心加工)喂养,第39周以0.5%胆固醇和99.5%玉米面混合饲料(由河北医科大学动物实验中心加工)喂养。整个造模期间以30%乙醇作为饮料让大鼠自由饮用,正常组则以正常饲料和纯净水喂养。实验9周末确认造模成功后予以分组治疗。2.2  分组及给药正常组随机抽取9只大鼠,将造模成功大鼠随机分为4组,每组随机抽取9只,雌雄各半。正常组：灌服生理盐水10 mL/kg体重,每日1次；模型组：灌服生理盐水10

12、 mL/kg体重,每日1次；消臌软坚丸低剂量组(简称“低剂量组”,药量相当于临床成人用量的7.5倍)：每日用药剂量为1.6 g/kg体重,每日1次灌胃；消臌软坚丸高剂量组(简称“高剂量组”,药量相当于临床成人用量的15倍)：每日用药剂量为3.2 g/kg体重,每日1次灌胃；阳性药对照组(简称“对照组”)：用复方鳖甲软肝片的混悬液灌胃,用药剂量为0.6 g/kg体重(药量相当于临床成人用量的15倍),每日1次灌胃。每次用药体积均按1 mL/100 g体重计算,共4周。2.3  标本制备    治疗4周末,于最后一次给药后禁食12 h,用10%水合氯醛(0.

13、2 mL/kg)麻醉大鼠,腹部正中切口,腹主动脉取血,立即以4 、3 500 r/min离心5 min,分离血清,密封,-20 冻存待检。大鼠取血后,迅速剖取肝脏,并在肝脏最大叶距边缘约0.5 cm处取1 cm×1 cm×1 cm大小组织块,置于4%多聚甲醛溶液固定24 h,逐级酒精脱水、透明、浸蜡、包埋、切片,采用HE染色法,光镜下观察肝硬化大鼠肝组织病理形态学变化。剩余肝组织匀浆,离心提取上清,-20 冻存待检。分别依据试剂盒要求测定血清和肝组织EGF含量。3  统计学方法    数据采用x±s表示,采用SPSS for

14、 windows 11.5统计软件,用方差分析、Student-Newman-Keul检验。4  结果4.1  各组大鼠病理形态学的变化    正常组大鼠肝脏柔软、红润、被膜光滑,肝组织结构完整、清晰,肝小叶结构正常,肝细胞排列规则成索状,在中央静脉周围呈放射状分布；肝血窦结构清晰,无异常改变；肝细胞呈多边形,胞浆均匀,细胞核形态正常。模型组大鼠肝脏体积有所增大,质地变硬,色黯红,切面可见多个小结节；肝小叶正常结构消失,间质内弥漫性淋巴细胞浸润；肝细胞体积明显增大,局部肝细胞出现严重的脂肪变性,可见到再生的肝细胞(双核)；肝间质广泛纤维组织增生

15、,将正常肝小叶分割成大小不等的肝细胞团(即假小叶形成)。高、低剂量组和对照组大鼠肝脏体积、质地、色泽与模型组比较均明显改善,接近正常组；肝小叶结构受损,少数肝细胞气泡样变性但仅偶见坏死细胞,较少炎性细胞浸润,少量纤维组织增生,但未见形成间隔。4.2  各组大鼠血清和肝组织表皮生长因子含量变化(见表1)表1  各组大鼠血清和肝组织EGF含量变化(略)注：与模型组比较,P0.05,P0.01；与对照组比较,P0.055  讨论    肝硬化腹水是临床上常见的危重病证,多由感受湿热疫毒或酒毒虫蛊,复因酒食不节,情志失畅,而致肝脾失调、气滞血

16、瘀、水液停聚,其中尤以脾虚血瘀,水湿内停为要。消臌软坚丸突出益气健脾、活血利水,方中鳖甲咸寒入肝脾血分,软坚散结,穿山甲咸能软坚,性善走窜,可透达经络直达病所；二者合用共为通络软坚、消癥化积之主药。丹参专入血分；泽兰芳香悦脾、疏利悦肝；黄芪益气健脾,脾健则积自消；配白术培固中州以制水之中源；葶苈子为肺家气药,宣肺利水,以开水之上源；沉香性温气香,降气平逆,兼纳肾气以理下焦；厚朴苦能下气,辛能散结,温能燥湿,兼理中下二焦之气滞；大腹皮下气宽中、行水消肿；佐以大剂甘淡渗利之品如茯苓皮、车前子、泽泻等以引湿邪外走。    EGF在肝脏中最重要的作用是促进上皮组织增殖和分

17、化,可促进胚胎肝小叶、肝内、外胆管的形成、生长和发育。肝脏有很强的转运并代谢EGF的能力,肝细胞通过特异性受体介导的胞吞作用摄入门脉血中的EGF,摄入的EGF以降解或完全的形式分泌到胆汁中。再生肝脏EGF受体分布与正常肝脏明显不同,再生肝脏细胞核EGF受体明显增加3。肝硬化常伴有炎性细胞因子水平的升高4,循环中出现多种自身抗体,可刺激EGF含量增加,促使肝组织结构破坏和纤维化的形成。何氏等5测定肝硬化患者无论有无腹水其血中EGF含量均明显高于正常人,尤以肝硬化腹水组为甚。    本实验结果表明,伴随着大鼠肝组织病理形态学变化,模型组大鼠血清和肝组织EGF含量较正常

18、组明显升高,分析其原因,可能是EGF可促进成熟肝实质细胞非实质细胞的胶原合成,特别是通过调节贮脂细胞增生环节,刺激DNA的合成,加速肝纤维化、肝硬化的形成6-7。经过用药治疗后,消臌软坚丸高、低剂量组和对照组均能明显降低EGF含量,且高剂量组作用较对照组显著。    综上所述,消臌软坚丸能显著改善肝硬化大鼠的肝脏病理组织学损害,具有促进肝脏的修复与再生,抑制胶原纤维合成、沉积,减轻肝损伤的作用,同时通过降低血清和肝组织EGF含量发挥抗肝脏纤维化,阻断肝硬化进程的作用,对腹水的产生与消退也产生积极的影响。    【参考文献】  1 戚忠玺,耿兰书,贡桂英,等.消臌软坚丸治疗肝炎肝硬化腹水88例的临床观察J.中医杂志,2004,45(5)：347349.2 韩德五,马学慧,赵元昌.肝硬化动物模型的研究J.山西医药杂志, 1979,(4)：15.3 邬善敏,戴植本.肝硬化患者肝脏表皮生长因子受体的表达及其意义J.中国组织化学与细胞化学杂志,1997,(2)：166.4 杨牧祥,王少贤,张一昕,等.柔肝消癥饮对肝硬化大鼠血清和肝组织IL-1和IL-6含量的影响J.中西医结合肝病杂志,2007,17(2)：100101,104.5 何浩明