放射抗拒性鼻咽癌细胞系的建立及差异表达基因

1、放射抗拒性鼻咽癌细胞系的建立及差异表达基因         11-01-07 10:11:00     编辑：studa20                  作者：王亚利，王西京，王中卫，金迎迎，李毅【摘要】  目的 筛选同一来源放射敏感性不同鼻咽癌细胞基因差异表达，探讨鼻咽癌放射抗拒机理。方法

2、用X射线间歇多次照射鼻咽癌细胞株CNE2建立放射抗拒性细胞CNE2R，采用BioStarH141s型基因芯片检测CNE2与CNE2R差异表达基因。结果 CNE2和CNE2R细胞有差异表达的基因308条，上调176个，下调132个。在差异表达的基因中，有76个位点出现6倍以上的差异，其中36个下调、40个上调，包括与DNA修复相关、细胞周期、凋亡、细胞骨架相关蛋白、细胞增殖、代谢、蛋白质合成、信号转导、免疫相关等方面相关的基因，基因分布变化较明显的主要是DNA修复相关基因、细胞骨架、细胞周期和凋亡相关基因。结论 CNE2细胞反复照射后产生放射抗拒性细胞，在基因水平上发生了某些突变，通过调控其中相

3、关基因，就有可能调控细胞的放射敏感性。 【关键词】  鼻咽癌；基因芯片；放射抗拒性ABSTRACT: Objective  To observe the differential gene expression in human nasopharyngeal carcinoma (NPC) cell line with different radiosensitivity by cDNA microarray analysis. Methods  A radioresistant cell line, CNE2R, was established from a h

4、uman nasopharyngeal carcinoma cells line CNE2 by repeated Xray irradiation. The differential gene expression of CNE2 and CNE2R was screened with cDNA microarray by BioStarH141s profile gene chip. Results  There were expressed 308 genes to be screened out between CNE2R cell line with different r

5、adiosensitivity and its parental CNE2 cell line, while 176 upregulated genes in CNE2R cells and 132 downregulated genes were found. In them, there were 40 upregulated ones and 36 downregulated ones whose ratios were higher than 6.0 or lower than 0.1. The different genes included DNA damage and repai

6、rrelated genes; cell cyclerelated and cytoskeletonrelated proteins; and apoptosisrelated genes. Conclusion  The radioresistant CNE2R cells were isolated from the CNE2 cell line by repeated Xray irradiation. The stable radioresistance is the result of coeffect by polygene and multiple factors, w

7、hich provide several gene targets to sensitize the radioresistant cells for improving the radiocurability of NPC.KEY WORDS: nasopharyngeal carcinoma; cDNA microarray; radioresistance放射治疗是鼻咽癌治疗最主要的手段，射线杀死了相对敏感的鼻咽癌细胞，而相对抵抗的亚细胞系则存活并增殖，成为复发的根源。近几年来,鼻咽癌的放射治疗的技术如调强放疗(intensity modulated radiation therapy,

8、 IMRT)，图像引导的调强放疗(image guided radiation therapy, IGRT)等取得了巨大的进展，但是如何克服放射抵抗性尚无理想途径。我们前期利用射线反复照射鼻咽鳞癌细胞株CNE2筛选出在形态学及放射生物学参数稳定的放射抗拒鼻咽癌细胞系CNE2R1。在此基础上对两株细胞进行2Gy照射后利用基因芯片分析二者差异表达的基因，以期发现与放射敏感性的相关基因，进一步建立鼻咽癌辐射相关基因芯片，为探讨鼻咽癌放射抗拒机理提供理论基础。1  材料与方法1.1  细胞培养 CNE2及CNE2R置于含100mL/L小牛血清、30g/L谷氨酰胺的RPMI

9、 1640培养液内，在37饱和湿度的培养箱内培养。1.2  集落形成实验 指数生长期细胞用2.5g/L胰蛋白酶+0.2g/L EDTA消化计数后制备单细胞悬液，接种于6孔板(2mL/孔)，每种细胞设6个复孔。根据不同细胞数目给予不同的照射剂量，细胞数2.0×102、2.0×102、1.0×103、1.0×104、1.0×105、1.0×106贴壁12h后分别接受6MVX射线单次剂量照射0、2、4、6、8、10Gy，将培养皿移入培养箱内，静止培养至6孔板出现肉眼可见的克隆(1420d)。甲醇固定、Giemsa染色、低

10、倍镜下计数所形成的集落数(50个细胞数的集落为有效的集落)。按照下述公式计算克隆形成率(plating efficiency, PE)=形成克隆数/种植细胞数×100%；存活分数(survival fraction, SF)=实验组克隆形成率/对照组克隆形成率×PE。绘制剂量-存活曲线，计算照射2Gy后细胞存活分数(SF2)。1.3  照射方法 Varian 2300C/D直线加速器6MVX射线照射，源皮距100cm，剂量率2Gy/min。表面覆1cm厚组织补偿胶。取指数生长的CNE2及CNE2R细胞，2.5g/L胰蛋白酶+0.2g/L EDTA消化成单

11、细胞悬液种植于25cm2培养瓶中，种植细胞密度为1.0×106/cm2，贴壁后6MVX射线照射2Gy，置于培养箱中继续常规培养24h用于后续研究。1.4  基因芯片 由上海博星基因芯片有限公司提供，型号为BioStarH141s。该芯片含有14112点的人类全长基因cDNA表达谱芯片，几乎涵盖了人类基因组的全部功能基因。分32阵，每阵由21×21个点组成，点样面积为18mm×36mm。阳性对照(包括管家基因)96个位点，阴性对照16点，内参基因20点，空白对照41点。1.5  基因芯片分析 取照射后24h的CNE2及CNE2

12、R细胞，用1mL Trizol(GIBCO公司)分别提取CNE2及CNE2R细胞的总RNA，用Qiagen公司的OligotexmRNAmidiKit从总RNA中分离poly+(A)mRNA，将所提取的mRNA进行逆转录，并用Cy5dCTP、Cy3dCTP标记两种cDNA。与BiostarH140s型芯片进行杂交并扫描，利用GenePixPro4.0图像分析软件处理数据判断基因是否在两个细胞中存在差异表达。用载体两端通用引物对全长基因进行PCR扩增，产物长度为10003000bp，琼脂糖电泳监控PCR质量。浓缩后的扩增产物作为靶基因溶解于点样液中，用CartesianPixsys 7500点样

13、仪点在硅烷化玻片上。点样后玻片进行2h水合、室温干燥30min，2g/L SDS、H2O及2g/L硼氢化钠溶液处理10min，晾干备用。一步法抽提CNE2与CNE2R细胞总RNA，将RNA沉淀溶解在RNasefree的MilliQ水中，测D(260)/D(280)，D(260)/D(230)。按Qiagen公司OligotexmRNAspincolumn操作进行RNA纯化。在50L逆转录反应体系中加入3g mRNA，逆转录合成及纯化cDNA探针，用Cy3dUTP标记CNE2细胞mRNA，用Cy5dUTP标记CNE2R细胞mRNA。乙醇沉淀后将Cy3dUTP和Cy5dUTP标记的探针混合溶解在20L 5×SSC+2g/L SDS杂交液中。ScanArray4000扫描仪扫描芯片，得到的