动脉粥样硬化家兔血浆及组织金属硫蛋白含量变化

1、    动脉粥样硬化家兔血浆及组织 金属硫蛋白含量变化        摘要目的：在家兔动脉粥样硬化(AS)模型上观察肝、主动脉组织及血浆金属硫蛋白(MT)含量变化，认识AS时机体氧化防御系统的改变。方法：家兔高脂饮食8周，复制高脂血症-动脉粥样硬化模型，分别以109Cd血红蛋白饱和法和硫代巴比妥酸法测定家兔肝、主动脉组织及血浆MT及丙二醛(MDA)含量。结果：AS家兔肝组织和血浆MT水平分别较对照组高318%(P0.01)和62%(P0.01)，而主动脉组织MT含量

2、较对照组低33%(P0.01)。肝、主动脉组织及血浆MDA含量分别较对照组高95%(P0.01)，76%(P0.05)和42%(P0.01)，肝组织，血浆MT变化与MDA变化相关。结论：AS家兔肝组织和血浆MT产生增多与脂质过氧化损伤有关。主题词金属硫蛋白；动脉粥样硬化；脂蛋白类；丙二醛中分类号R543.1文献标识码A文章编号1000-4718(2000)07-0600-03 Changes of metallothionein contents in plasma and tissuesof rabbit with atherosclerosisLI Shu-lian, WANG Xiao-

3、hong, XUE Lin, LIN Jing, ZHAO Chun-yu, TANG Chao-shu(Institute of Cardiovascular Research, The First Hospital, Beijing University, Beijing 100034, China)AbstractAIM： To observe the level of metallothionein (MT) in liver, aorta and plasma of rabbit with atherosclerosis (AS) in order to recognize the

4、alteration of oxidative defense system in body when AS occurred.METHODS:Preparation of AS model of rabbit induced by having high-fat diet for eight weeks; the levels of MT and malondialdehyde (MDA) were measured in the tissues of liver and aorta and plasma of rabbit.RESULTS:The MT levels in liver ti

5、ssues and plasma in atherosclerotic group increased 318%(P0.01) and 62% (P0.01), compared with control group, but its level in aortic tissue in atherosclerotic group decreased 33% (P0.01). The MDA levels in liver, aortic and plasma in atherosclerotic group increased 95%(P0.01), 76%(P0.01) and 42%(P0

6、.01), respectively, compared with control group. The changes of contents of MT in liver and plasma have relation with level of MDA in liver tissues and plasma.CONCLUSION:The alteration of MT in liver tissues and plasma in atherosclerotic rabbits may be related to lipid hyperoxidative injury.MeSHMeta

7、llothionein; Atherosclerosis; Lipoproteins, LDL; Malondialdehyde动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)的发病机制迄今尚未完全阐明，大量实验和临床证据表明氧化应激参与了AS发病过程，尤其是氧化修饰低密度脂蛋白是AS发生的重要危险因素1。金属硫蛋白(metallothionein, MT)是体内富含-SH基的可诱导应激蛋白，具有清除自由基，抗脂质过氧化作用2，是机体重要的抗氧化防御体系之一。本实验在家兔AS模型上观察肝、主动脉组织及血浆MT含量变化，以认识AS时机体氧化防御系统的变化。材料和方法一、家兔AS模型复制3日

8、本大耳白兔(本校实验动物中心提供)雌雄各半，体重2.53.0 kg，随机分为两组。(1)对照组(n=6)：普通全价营养饲料(粗蛋白20%，粗脂肪13%，碳水化合物60%，灰分1%，维生素混合物1%)连续喂养8周；(2)高脂组(n=6)：在普通全价营养饲料基础上添加10%胆固醇和20%猪油乳剂连续喂养8周。全部动物于实验前及第8周末分别耳缘静脉采血，分离血浆，实验结束时腹腔注射戊巴比妥钠(50 mg/kg)麻醉后处死，立即取肝脏和主动脉全长(自升主动脉至髂动脉分叉处)用以实验。二、血脂与脂蛋白(a)含量测定血清甘油三酯(TG)，总胆固醇(TC)和高密度脂蛋白(HDL-C)测定参考杨永宗4等的方法

9、，按试剂盒说明书进行。脂蛋白(a)LP(a)按Boeheringer Mannheim公司试剂盒说明书进行。三、主动脉粥样硬化斑块面积(%)测算摘取家兔主动脉迅速放入4生理盐水中，去掉血管外壁脂肪组织和结缔组织，沿纵向剖开血管壁并平铺于玻璃板上，暴露血管壁内侧，血管动脉粥样硬化处呈明显的白色粥样斑块。黑白照相，以方格计算法计算主动脉粥样斑块占该主动脉总面积的百分比(%)。四、肝、主动脉组织及血浆MT含量测定5肝和主动脉组织于10 mmol/L Tris-HCl pH 7.4缓冲液中制备匀浆、离心，取上清，100煮沸5 min。离心、去除沉淀。取上清或血浆200 L，加入200 L，109Cd液

10、(含Cd22.0 g/mL，109Cd2 37 kBq/mL)混匀，37温育10 min。加入100 L 2%牛血红蛋白，混匀，100煮沸2 min，冷却，离心沉淀。反复用牛血红蛋白沉淀操作3次。取上清液200 L于-计数仪上测定109Cd放射强度，并换算出MT含量(pmol/mg组织，pmol/mL血浆)。五、肝、主动脉组织及血浆丙二醛含量测定6±s表示，用组间t检验判断均数差异显著性。结果一、家兔血脂变化及动脉粥样斑块形成实验前对照组与高脂组家兔血浆TG，TC，HDL-C及LP(a)水平相近，差异无显著(P0.05)。高脂饲养8周，家兔血浆TG，TC和LP(a)水平分别高于对照组

11、1.4倍(P0.01)，7.4倍(P0.01)，14.7倍(P0.01)，血浆HDL-C低于对照组50%(P0.01)。结果见表1。表1家兔血脂及脂蛋白含量Tab 1The contents of plasma lipids and lipoproteins in rabbits (±s，n=6)TG(mmol/L)TC(mmol/L)HDL-C(mmol/L)LP(a)(mg/L)Control group1.0±0.33.4±1.50.8±0.240.7±29.1Before experiment1.2±0.42.9±0

12、.90.9±0.158.8±14.2hyperlipidemia groupAfter experiment2.4±0.728.6±9.60.4±0.1642.4±50.4hyperlipidemia group?P0.01，vs control group对照组家兔无动脉粥样斑块存在，高脂饮食8周后，主动脉可见散在的白色斑块，以主动脉弓和髂动脉分叉处最明显，动脉粥样斑块的总面积占整条动脉面积之比为11.1%±1.6%。二、家兔肝、主动脉组织及血浆金属硫蛋白含量变化动脉粥样硬化家兔肝组织及血浆MT含量分别高于对照组318%(

13、P0.01)，62%(P0.01)，而动脉组织MT含量低于对照组33%(P0.01)，结果见1所示。Fig 1The contents of MT and MDA in liver, aorta and plasma (±s，n=6)?P0.05，?P0.01，vs control1肝、主动脉组织及血浆MT和MDA的含量三、家兔肝、主动脉组织及血浆MDA含量变化动脉粥样硬化家兔肝、主动脉组织和血浆MDA含量分别高于对照组95%(P0.01)，76%(P0.05)和42.4%(P0.01)，结果见1。四、家兔肝组织及血浆MT与MDA含量呈显著正相关对照组与高脂组肝组织及血浆MT含量与M

14、DA含量呈显著正相关，在肝组织r=0.93(P0.01)，血浆r=0.81(P0.01)。讨论AS的发生与多种因素有关，但氧化应激和氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，OX-LDL)的形成是其重要原因1。金属硫蛋白(MT)是一类富含疏基及金属的非酶类蛋白，除具有重金属解毒及调节金属代谢平衡外，还具有强大的清除自由基、抑制脂质过氧化作用2，是机体重要的内源性应激保护蛋白和抗氧化物质。本实验观察到高脂饲喂家兔8周，血浆TG、TC、LP(a)含量显著增高，而清除、转运胆固醇，抗AS形成的HDL-C明显下降，主动脉硬化斑块面积达11.1%，表明家兔高脂饮

15、食促发了AS形成。AS家兔肝组织、血浆MT含量显著高于对照，并且与脂质过氧化产物MDA含量变化相关。值得注意的是，AS肝组织、血浆MT含量增高的同时，主动脉组织MT含量反而下降，这可能是动脉粥样斑块的形成损伤了主动脉组织合成MT的能力。关于AS家兔肝、主动脉组织及血浆MT变化的机制尚不完全清楚。MT为一可诱导应激蛋白，重金属、激素、细胞因子及氧化应激等都可诱导MT高表达，MT可为多种组织细胞诱导合成，其中肝脏是产生MT的主要部位。心肌缺血、缺血-再灌注损伤等病理情况下肝脏MT含量显著增高，并与氧自由基的产生有关7。高脂血症家兔血浆内存在有OX-LDL及OX-VLDL，AS病灶中亦存在OX-LD

16、L8。氧自由基、OX-VLDL均可损伤内皮细胞，促细胞因子(IL-1)和生长因子释放，而诱导MT产生。本实验中AS家兔肝组织、血浆MT含量显著增高，并且与脂质过氧化产物MDA含量变化相关，提示MT产生增多与AS家兔自由基、OX-LDL等引起的过氧化损伤有关。MT作为机体的内源性应激蛋白，可在多种因素诱导下大量产生，通过其清除自由基、抑制脂质过氧化等作用而增强机体的抗损伤反应。已有大量实验证明，MT在缺血、缺氧、缺血-再灌注损伤等病理过程中的高表达都具有细胞保护作用。本实验观察到的动脉粥样硬化家兔体内MT含量增高可能也是机体的一种代偿适应性保护反应。外源性给予或内源性诱导MT产生可能是防治AS发

17、生发展的措施之一。基金项目 国家自然科学基金资助(No.39730220)李淑莲（河南开封医学专科学校）王晓红（北京医科大学第一医院心血管病研究所，北京 100034）薛林（北京医科大学第一医院心血管病研究所，北京 100034）林静（北京医科大学第一医院心血管病研究所，北京 100034）赵春玉（北京医科大学第一医院心血管病研究所，北京 100034）唐朝枢（北京医科大学第一医院心血管病研究所，北京 100034）参考文献1Liu SX, Zhou M, Chen Y, et al. Lipoperoxidative injury to macrophages by oxidatively

18、modified lipoprotein may play an important role in foam cell formationJ. Atherosclerosis, 1996, 121:5561.2Masao Sato, Lan Bremner. Oxygen free radicals and metallothioneinJ. Free Radical Biol Med, 1993,14:325330.3Hasenfuss G. Animal models for cardiovascular disease, heart failure and hypertrophyJ. Cardiovasc Res, 1998, 39:6076.4杨永宗，陈颜芳，刘易林，等.L-精氨酸对高脂血症家兔血浆脂蛋白，一氧化氮和脂过氧化的影响.中国动脉粥样硬化杂志，1997，5(3)：206208.5David LE, Brian FT. Evaluation of the Cd/hemoglobin affinity assays for the rapid determination of metallothionein in biological tissuesJ. Toxical Appl