减毒沙门菌在禽用疫苗应用中的研究进展＊

1、减毒沙门菌在禽用疫苗应用中的研究进展    核心提示：张丽君，罗开健* (华南农业大学兽医学院，广东广州 510642) 摘要：减毒沙门菌感染宿主细胞后，可诱导机体产生强烈的体液免疫、细胞免疫和黏膜免疫反应，不仅可以用作疫苗，而且也是理想的疫苗载体。文.张丽君，罗开健* (华南农业大学兽医学院，广东广州 510642) 摘要：减毒沙门菌感染宿主细胞后，可诱导机体产生强烈的体液免疫、细胞免疫和黏膜免疫反应，不仅可以用作疫苗，而且也是理想的疫苗载体。文章对禽用疫苗中的减毒沙门菌活疫苗、减毒沙门菌携带的重组疫苗和DNA疫苗的研究进行了综述，以期为新型禽用疫苗的

2、研究提供参考。 关键词：减毒沙门菌；活疫苗；重组疫苗；DNA疫苗 沙门菌属于肠杆菌科沙门菌属，为革兰氏阴性杆菌，无芽孢，无荚膜，除极少数外，通常都以周生鞭毛运动。其菌型繁多，迄今为止已发现2 000种以上的血清型，广泛存在于人和各种动物的肠道内。在自然界中，家禽是其最主要的贮存宿主。禽沙门菌病按病原体抗原结构的不同可分为3类，即由鸡白痢沙门菌引起的鸡白痢，由鸡伤寒沙门菌引起的禽伤寒，由其他有鞭毛、能运动的沙门菌引起的禽副伤寒。其中鸡白痢和禽伤寒沙门菌有宿主特异性，主要引起鸡和火鸡发病，而禽副伤寒沙门菌则能广泛感染各种动物和人。目前，禽副伤寒沙门菌病具有重要的公共卫生意义。另外，随着家禽业的迅速

3、发展以及高密度饲养模式的推广，沙门菌病也已成为家禽最重要的蛋传递性细菌病之一，每年由此造成的经济损失很大1。 分子生物学和DNA重组技术以及对沙门菌毒力遗传学的深入研究和了解，为在该病原体基因组中引入多重、限定、减毒和不能回复的突变提供了可能性2。通过各种技术对沙门菌进行减毒，并感染宿主细胞后，发现沙门菌可在体内长期存活，并诱导产生体液、黏膜和细胞介导的免疫反应。减毒沙门菌是一个有效的运送重组抗原的系统， 这些抗原可来自多种病原体，包括细菌、病毒和寄生虫的抗原，甚至肿瘤抗原3。同时，利用减毒沙门菌携带DNA疫苗的研究也成为热点。因此， 减毒沙门菌既可作为针对同源抗原的活疫苗， 也可作为表达外源

4、抗原的宿主菌，还可以作为携带DNA疫苗的活载体。 鉴于减毒沙门菌的以上特性，目前的研究已显示出诱人的前景，故对减毒沙门菌及其在禽用疫苗应用中的研究进展进行概述。 1减毒沙门菌的研究背景 减毒沙门菌可侵入到宿主的派伊尔氏结、肠淋巴结、肝、脾等组织细胞表达异源抗原，不仅激发出宿主针对伤寒杆菌本身的免疫反应，而且激发出针对其所携带抗原的各种免疫反应，包括局部体液免疫、全身体液免疫和细胞免疫反应，尤其是细胞毒T淋巴细胞(CTL)作用。由于减毒沙门菌可通过口服或鼻黏膜进行免疫接种，因此，用其制成的疫苗接种方式简单，易于大规模的使用。此外，以减毒沙门菌为载体的疫苗制备简单、易于储存和运输、抗原不需提纯，所

5、以可显著降低疫苗的制作成本。因此，减毒沙门菌是异源抗原免疫的优良载体4。目前，以胞内细菌作为载体传递DNA疫苗是研究的焦点之一， 因为它可直接将抗原递呈给抗原递呈细胞(APC)，产生针对病原的特异性免疫保护反应。因此，减毒沙门菌以其有效地递呈抗原和激发黏膜免疫的优势也被广泛用于DNA疫苗新型细菌载体的研究5。 2减毒沙门菌活疫苗 与常规的灭活疫苗或亚单位疫苗相比，减毒活疫苗具有使用方便及免疫原性好等优点。以口服方式进行免疫接种，一次免疫就可以提供保护。减毒株还可以进一步减少疫苗的副反应，并不会因限饲或改变免疫动物的饮食结构而毒力返强。此外，减毒株还能有效侵入并持续刺激机体产生初次免疫应答和再次

6、免疫应答6。最后，活的细菌疫苗生产成本低，且宜于大规模应用。 最早的减毒沙门菌活疫苗是鸡伤寒沙门菌9R突变株，该株是野生型鸡伤寒沙门菌9R株的粗糙型突变体，不能合成脂多糖，由将野生型通过低营养培养基反复培养后得到。该突变株可诱导成年鸡对鸡伤寒沙门菌野生型感染的保护性免疫反应，但具残余毒性，可致肝、脾损害，并可在体内滞留数周、数月并经蛋进行传播，Barroow等进一步将野生型9R株的毒力质粒消除，肌注免疫后可诱导对野生型菌株的口服攻击，但效果不如9R株。 在试验中最为广泛使用的减毒沙门菌突变株可能是发生了芳香族氨基酸合成途径基因突变的aroA菌株(不能合成分支酸， 限制了细菌在脊椎动物组织中的生

7、长)。aroA突变株在小鼠免疫后表现良好，能产生特异性抗体反应、细胞免疫反应以及整体保护性免疫反应。Cooper等对肠炎沙门菌aroA突变株对家禽的免疫效果进行了系统的试验研究，aroA突变株经口感染1日龄雏鸡后可在小肠定居，并可在盲肠繁殖，但不引起病症，同时诱导抗野生型的保护性免疫反应。Tan等以鼠伤寒沙门菌的aroA突变活疫苗免疫鸡， 然后再以野生型鼠伤寒沙门菌或肠炎沙门菌攻毒， 发现疫苗株在粪便中存活不超过26 d， 但免疫后不能减少粪便中野生型鼠伤寒沙门菌或肠炎沙门菌的排出量。Parker等以aroA鼠伤寒沙门菌疫苗接种鸡，然后以致病性肠炎沙门菌攻毒， 免疫鸡与未免疫鸡相比，免疫鸡的卵

8、巢、输卵管和盲肠内容物中的细菌数更少， 但差异不显著7。 cya和crp基因编码酰苷酸环化酶/cAMP受体蛋白，cya/crp基因缺失后消除了细菌在哺乳动物中摄取cAMP的惟一途径，因此在宿主细胞内不能转化成野生型菌株。目前研制出的Megan Vac疫苗是cya和crp基因突变的鼠伤寒沙门菌，家禽口服接种疫苗后，可以特异性地降低沙门菌感染，产生特异性的体液免疫和细胞免疫应答，显著降低野生型菌株在禽体内的重新定殖，而且还可以产生交叉保护。种鸡群接种Megan Vac疫苗后，可产生持久的、具有保护性的母源抗体，大大降低了沙门菌污染鸡蛋的可能性8。X3985是cya/crp基因缺失的菌株，这种突变株

9、已被美国农业部做为抗鸡的沙门菌感染的疫苗9。 除了以上几种减毒株外还有galE突变株、nuoG株和purE株等。Pritchard等用鼠伤寒沙门菌galE突变株对1日龄雏鸡进行口服免疫后能使其产生保护性免疫，2周后用野生株攻击，粪便排菌量显著降低，带菌状态明显改善。nuoG株不能定居2周龄鸡的肝脏和脾脏，定居盲肠部位的能力与野生型相比大大减弱，单一剂量口服免疫使2周龄鸡患病率降低8%75%不等。McfarLand等研究发现，purE突变株在小鼠模型高度减毒，但免疫原性低下，诱导产生的保护性免疫反应较弱。鼠伤寒的purE株在家禽表现出良好的免疫效果，目前在德国较为广泛地使用。 3减毒沙门菌携带的

10、重组疫苗 减毒沙门菌菌株已广泛用作预防人和动物沙门菌感染的活疫苗。同时，减毒沙门菌是最早用做活疫苗载体的病原菌之一， 也是研究最深入的活菌疫苗载体。它能刺激宿主各个水平的免疫系统，诱导全身和黏膜免疫应答、型和型辅助T细胞应答以及随后的细胞因子表达10。它是异源抗原的优良载体。用减毒沙门菌作为表达载体的宿主菌，将亚克隆有候选抗原基因的表达载体转化到减毒沙门菌中，外源抗原在沙门菌中表达，并在其携带下经口服或经鼻、直肠、阴道黏膜进入机体，达到刺激机体产生特异性免疫反应的目的11。已有很多细菌、病毒、寄生虫抗原基因被克隆转化到减毒沙门菌中表达，并经口服接种后获得了很好的免疫保护作用。 禽类及其产品是人

11、类感染弯曲菌病和沙门菌病的主要来源。Wyszynska A等12将3个编码空肠弯曲菌高免疫原性蛋白的基因(CjaA，CjaC，CjaD)引入减毒的鼠伤寒沙门菌中，制备成重组疫苗。鸡经口服接种表达弯曲菌CjaA基因的沙门菌疫苗后，不仅在血清中检测到IgG，而且还检测到了黏膜型IgA，二者均可抵抗弯曲菌的膜蛋白和沙门菌的OMPs。疫苗接种后异源野生型空肠弯曲菌在鸡盲肠中的定居能力大大降低，从而证明用减毒沙门菌运送异源抗原是一种很好的接种途径。 4减毒沙门菌携带的DNA疫苗 沙门菌不仅是可用于表达外源抗原的宿主菌，还可作为携带DNA疫苗的活载体。将带有真核启动子的核酸DNA质粒中插入编码外源抗原的目

12、的基因，通过沙门菌携带到宿主抗原递呈细胞(APCs)中，核酸疫苗DNA进入这些真核细胞中便可以在真核启动子的启动下表达目的抗原蛋白，抗原在APCs中便可以与主要组织相容性复合体(MHC)相结合，同时递呈给免疫反应细胞，沙门菌携带的DNA核酸苗刺激CTL反应比单纯的抗原刺激的反应要强 13-14，对减毒沙门菌在核酸疫苗中的应用研究已成为热点。 梁雪芽等将携带NDVF48E9株F基因的真核表达质粒pcDNA3-F转化减毒鼠伤寒沙门菌ZJ株(ZJ/pcDNA3-F)口服接种小鼠和雏鸡，结果表明，用减毒沙门菌作为载体传递基因疫苗具有良好的安全性、稳定性和免疫原性，从而为以后的研究工作打下了良好的基础1

13、5。 张小荣等16将鹅源H5亚型高致病力禽流感病毒HA基因的重组真核表达质粒pVAXI-HA和asd-pVAXI-HA转化减毒鼠伤寒沙门菌X4550得到两种运送DNA疫苗的重组沙门菌，然后免疫小鼠，不仅可以检测到HA特异性的血清抗体应答，而且还能抵抗稳定表达H5亚型禽流感病毒HA基因的P815肥大细胞瘤的攻击，说明该运送DNA疫苗的减毒沙门菌系统在体内能够成功释放所携带的质粒，并且能够刺激机体产生保护性免疫应答。 潘志明等17将鹅源新城疫病毒分离株JS5F基因的重组真核表达质粒pVAX12F转化减毒鼠伤寒沙门菌SL7207，构建成携带DNA疫苗的重组沙门菌并将其以不同剂量口服免疫1日龄雏鸡，结

14、果表明，细菌对雏鸡具有良好的安全性，且不影响鸡的增重。再将重组菌口服免疫1日龄商品代伊莎褐蛋鸡，结果显示重组菌能激发机体产生特异性抗体。 焦凤超等18将运送H5亚型禽流感病毒DNA疫苗重组减毒鼠伤寒沙门菌口服接种1日龄SPF雏鸡，结果表明重组菌对雏鸡具有良好的安全性。将重组菌SL7207(pVAXI-HA)和X4550(asd-pVAXI-HA)口服免疫1日龄商品代伊莎褐蛋鸡，同时，将重组菌分别与pVAXI-IFN-或pVAXI-IL2联合免疫，通过测定小肠黏膜抗体效价，结果显示，重组菌单独免疫组和联合免疫组均能激发机体产生黏膜免疫应答。攻毒后，免疫保护结果显示，无论是重组菌单独免疫组还是联合免疫组均与空载体组和空白对照组之间存在显著性差异，而重组菌单独免疫组与联合免疫组之间不存在显著性差异，说明重组菌能够提供机体抵抗HPAIVH5亚型强毒攻击的良好的免疫保护作用，为进一步筛选出黏膜免疫途径的新型禽流感基因工程疫苗奠定了基础。 杜爱芳等19-20将鸡柔嫩艾美耳球虫5401基因的真核表达质粒pcDNA3- 5401，高压电转化到dam和phoP基因双突变的减毒鼠伤寒沙门菌(ZJ株)中， 构建重组ZJ/ pcDNA3- 5401菌株。将其直接转染Vero细胞， 证明了减毒沙门菌