气相色谱内标法测定沙棘果肉油和种子油中的主要脂肪酸

1、气相色谱内标法测定沙棘果肉油和种子油中的主要脂肪酸摘要：以 5 个沙棘（ Hippopha ？ ?c rhamnoides L.）品种的果实为试材，建立气相色谱内标法测定沙棘果肉油和种子油主要脂肪酸成分的方法。 果肉油和种子油采用氯仿-甲醇法提取， 甲醇钠 -甲醇法甲酯化衍生后进行定性和定量。结果表明，十九烷酸甲酯是气相色谱法测定沙棘果实中脂肪酸成分含量的理想内标物。果肉油和种子油中的主要脂肪酸为棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、油酸、亚油酸和 -亚麻酸。果肉油中棕榈油酸（ 36.25%）和棕榈油酸（ 28.92%）含量高， -亚麻酸含量低；种子油中亚油酸（ 33.65%）和 -亚麻酸（32.95%）

2、含量高，棕榈油酸含量低。 5 个品种沙棘的果肉油和种子油中主要脂肪酸的组成及含量存在一定的差异。亚历山大 12 号果肉油中的脂肪酸含量最高，为 84.84 g/100 g 油；无刺丰种子油中的脂肪酸含量最高， 为 88.39 g/100 g 油。该方法操作简便、快速、重复性好，适合沙棘油脂样品中脂肪酸的定量测定。关键词：沙棘（ Hippopha ？ ?c rhamnoides L. ）；果肉油；种子油；脂肪酸；内标法；定量分析中图分类号： S793.6；O657.7+1 文献标识码： A 文章编号： 0439-8114（ 2017）09-1734-05DOI：Sea Buckthorn by

3、GC Internal Standard Method YANG Ming-xuan， ZHOU Yang， LU Jun，LI He（ College of Environment and Resources， Dalian MinzuUniversity ， Dalian 116600， Liaoning， China） Abstract ： A gas chromatographic method fordetermination of fatty acids in pulp oil and seed oil was established with five cultivars of

4、sea buckthorn berries as materials. The pulp oil and seed oil were extracted using chloroform-methanol method. The qualitative and quantitative analysis of fatty acids in oils were performed after they were methylated with CH3ONa-CH3OH. The results showed that methyl nonadecylate was optimal interna

5、l standard to analyse the contents of fatty acids in pulp oil and seed oil from sea buckthorn. The main fatty acids included palmitic ， palmitoleic ，stearic， oleic， linoleic and -linolenic acids. In pulp oil ， the contents of palmitoleic acid （36.25%） and palmitic acid（ 28.92%） were high and -linole

6、nic acid was few. In seed oil ，the contents of linoleic acid （ 33.65%） and -linolenic acid（ 32.95%） were high and palmitoleic acid was few. There were some differences in composition and content of main fattyacids among five cultivars. The pulp oil from Yalishanda-12 exhibited the highest content of

7、 total fatty acids at 84.84 g/100 g oil， respectively. The seed oil from Wucifeng contained highest total fatty acids at 88.39 g/100 g oil. The method is simple ， effective and accurate for the fatty acid determination of sea buckthorn oil samples.Key words：sea buckthorn（Hippopha ？ ?c rhamnoides L.）

8、；pulp oil ；seed oil； fatty acid ； internal standard method ； quantitative analysis沙棘（Hippopha ？ ?c rhamnoides L.）又名酸刺、 醋柳等，胡?j 子科沙棘属多年生落叶灌木或小乔木，适应性强，耐干旱，盐碱，是中国重要的生态经济植物 1 。沙棘的果肉、种子和叶都含有油，即果肉油、种子油、叶油，其含油量受到基因型、生长环境、成熟时期等影响。通常所说的沙棘油主要指果肉油和种子油，二者富含不饱和脂肪酸，例如果肉油中有较多的棕榈油酸、油酸，种子油中的亚油酸和亚麻酸较多2， 3。沙棘油经济价值极高，作

9、为药用原料，广泛用于治疗烧伤、烫伤、冻伤等，对扁桃体炎、口腔炎、结膜炎等都有显著疗效，另外它还能调节免疫系统，对于心、脑血管系统疾病以及肿瘤、癌症等有预防作用4，5。沙棘油中的脂肪酸组成及含量是衡量果实品质的一个重要指标。国内外针对沙棘油脂肪酸含量的检测主要集中于脂肪酸组分相对含量的测定6-8 ，而脂肪酸绝对含量测定的研究相对较少。本试验在进行内标物的选择和色谱条件的优化之后，建立了气相色谱内标法测定沙棘果肉油和种子油中脂肪酸的方法，促进了沙棘种质资源评价和综合开发利用。1 材料与方法1.1 材料供试的 5 个沙棘品种（壮圆黄、无刺丰、柳沙1 号、西伯利亚红晕、亚历山大 12 号）的成熟果实于

10、 2013 年 7 月采自辽宁省阜新沙棘良种选育研究所（ E121° 28， N42°26），-50 长期保存。1.2 主要试剂、仪器37 种脂肪酸甲酯、棕榈酸甲酯、棕榈油酸甲酯、硬脂酸甲酯、油酸甲酯、亚油酸甲酯、亚麻酸甲酯和十九烷酸甲酯的分析标准品均购自 Sigma-Aldrich（中国）公司，色谱纯级，纯度 99%；氯仿、甲醇和正己烷购自美国Heonywell Burdick& Jackson 公司，均为色谱纯级，纯度 99%；甲醇钠，氯化钾为分析纯，购自生工生物工程上海（股份）有限公司。GC-2010 型气相色谱仪及工作站（日本SHIMADZU）；Labcon

11、co 低温冷冻浓缩机（美国Labconco）； Mettler ToledoAB135-S型电子分析天平 （瑞士Mettler Toledo ）；XW-80A 微型旋涡混合仪（上海沪西分析仪器厂）。1.3 方法果肉油及种子油提取取适量冷冻保存的沙棘果实真空冻干4 d（ 11 Pa，-53 ）。冻干后的果实放入研钵中，取出种子（自然风干后保存） ，倒入液氮快速研磨至粉末状，再次真空干燥1 d（ 11 Pa， -53 ），取出后 -20 保存。果肉油的提取：取1 g 果肉粉末于50 mL 离心管中，加入 10 mL 甲醇搅拌混匀1 min，再加入20 mL 氯仿搅拌混匀2min ，彻底混匀后过滤，

12、残渣用20 mL 的氯仿-甲醇（2 1，V/V）重新悬浮，混匀后过滤， 残渣用 10 mL 的氯仿 -甲醇（ 21，V/V）再悬浮，混匀过滤， 收集滤液，加入 1/4 体积的 0.88%的 KCl，摇匀静置， 分层后除去上层， 对下层用 1/4 体积的甲醇-水（ 1 1，V/V）洗涤，移去上层重复上一步骤，移去上层，将下层过滤，滤液于 -20 保存。种子油的提取：取 1 g 风干种子，经液氮研磨成粉末，移到 50 mL 离心管内，余下步骤与果肉油提取方法相同。样品的甲酯化 准确量取 500 L 上述样品，参考Christie9 的方法，采用甲醇钠-甲醇法对样品进行甲酯化处理。分析前向甲酯化的样

13、品中加入5001 000 L 含有1mg/mL十九烷酸甲酯的正己烷，充分溶解后经0.45 mL滤膜过滤待测。色谱条件色谱柱： Agilent-DB23 色谱柱（60 m×0.25 mm ×0.25 m）；柱箱：90 ；SPL1（进样口）：250 ；载气：高纯氮气；柱流量： 0.8 mL/min ； FID2（检测器）：270 ；分流比 301，进样量 1 L。柱箱升温程序：初始温度为 90 ，以 9 /min 的速度升温至 190 ，再以 3 /min 的速度升温至 215 ，保持 10 min ，再以 3 /min 的速度升温至 230 保持 5 min ，最后以 3 /

14、min 的速度升温至 245 保持 5 min 。混标的配制及标准曲线的制定称取适量棕榈酸甲酯、棕榈油酸甲酯、 硬脂酸甲酯、 油酸甲酯、 亚油酸甲酯、亚麻酸甲酯标准品， 用含有 1 mg/mL 十九烷酸甲酯的正己烷溶液分别配制成 5、 5、 2、 4、5、 5 mg/mL 的 6 种脂肪酸甲酯储备液。按表1 的浓度梯度，取适当体积的每种储备液，用含有浓度为1 mg/mL 正己烷（ 190）的溶液定容， 配制 8组脂肪酸甲酯的混合标准品（混标）。根据果肉和种子中脂肪酸的组成特点，选择适合的浓度范围，应用GCsolution 工作站内标法制定每种脂肪酸甲酯相应的标准曲线。数据统计分析按上述色谱条件

15、，根据标准样品的保留时间和峰面积对样品进行定性定量。采用SPSS 22.0软件进行单因素方差分析和差异显著性分析。2 结果与分析2.1 色谱条件的确定及内标物的选择图 1 是 37 种脂肪酸甲酯标准品的总离子流色谱情况，在该色谱条件下， 37 种脂肪酸甲酯混合标准品显示出较好的分离效果，其出峰时间在 6 45 min 之内，可用于待测沙棘油中脂肪酸成分的定性。如图 2 和图 3 所示，沙棘果肉油和种子油中所有的脂肪酸甲酯显示出较好的分离效果和较高的信号响应，与37 种脂肪酸甲酯混标的出峰时间一致性高。利用GCsolution 软件将样品的总离子流与 37 种脂肪酸甲酯混标的色谱图进行比对后定性

16、。根据出峰时间、峰高和峰面积可判断，沙棘果肉油和种子油中的主要脂肪酸包括棕榈酸（C16： 0）、棕榈油酸（ C16： 1）、硬脂酸（ C18：0）、油酸（ C18： 1c）、亚油酸（ C18：2c）和 -亚麻酸（C18：3n3）6?N，集中在 2030 min被分离，但它们在果肉油和种子油中的组成有所不同。植物油脂中脂肪酸的定量常以十五烷酸及其甲酯、十七烷酸及其甲酯作为内标物，也有用十三烷酸及其甲酯作为内标物。但由图 2 和图 3 可见，上面提到的内标物不适于本试验。在柳沙 1 号沙棘的果肉油和种子油中，均检测出了十五烷酸（ 15： 0）和十七烷酸（ C17：0），前者在果肉油和种子油中为微量

17、，出峰时间大约在 19 min ；后者在果肉油中含量稍高，种子油中为痕量，出峰时间大约在22 min 。另外，沙棘果肉和种子中的主要脂肪酸为16 碳和 18 碳脂肪酸，出峰时间集中在20 30 min ，十三烷酸甲酯作为内标物出峰时间距离这一范围较远，不是理想的内标物。图4 为供试样品不加十九烷酸甲酯和加入十九烷酸甲酯作为内标物的对比色谱。十九烷酸甲酯的出峰时间在被测物出峰范围之内，且与被检测物分离效果明显，不与已知脂肪酸甲酯反应，可以有效起到内标物的作用，表明其是理想的脂肪酸定量的内标物。因此本试验选择沙棘果肉油和种子油中均未检测到的十九烷酸甲酯作为脂肪酸定量所用内标物。本研究首次建立了以十

18、九烷酸甲酯为内标的气相色谱法测定沙棘油脂肪酸的方法，为沙棘油脂肪酸的绝对含量提供了有效的方法，有助于沙棘油脂肪酸的精确检测和深度开发。参考文献：1 RUAN C J，RUMPUNEN K， NYBOM H. Advances inimprovement of quality and resistance in a multipurpose crop ： Sea buckthornJ.Critical Reviews in Biotechnology ， 2013， 33： 126-144.2 张哲民 .沙棘果油与籽油内含物之若干比较 J.国际沙棘研究与开发， 2007， 5（ 3）： 1-4.

19、3 张凤枰，索有瑞，王洪伦，等 .毛细管气相色谱内标法测定沙棘油中的脂肪酸 J.中国粮油学报， 2008 ，23（ 1）：198-202.4 胡 兰，热娜 ?卡斯木 .两产地沙棘挥发油中化学成分的比较 J.华西药学杂志， 2009， 24（ 2）： 152-154.5 CHEN C， XU X M， CHEN Y， et al. Identification ，quantification and antioxidant activity of acylated flavonol glycosides from sea buckthorn （ Hippophae rhamnoides ssp.

20、sinensis） J.Food Chemistry， 2013， 141： 1573-1579.6 YANG B R， KALLIO H P.Fatty acid composition of lipidsin sea buckthorn （ Hippopha rhamnoides L.） berries of different originsJ.Journal of Agricultural and Food Chemistry ，2001， 49： 1939-1947.7 SUSAN D S G， STEFAN C. Influence of harvest time on the quality of oil-based compounds in sea buckthorn（ Hippophae rhamnides L. ssp. sinensis） seed andfruitJ.Journal of Agri