人粘蛋白糖链单抗的制备及在胃化生粘膜和胃肿瘤中的应用

1、人粘蛋白糖链单抗的制备及在胃化生粘膜和胃肿瘤中的应用    王悦增李玉林张丽红三富弘之冈安粆 摘要目的：制备抗胃肠道粘蛋白糖链单抗(HGMs和HCMs)，并研究其抗原在胃粘膜、化生粘膜及肿瘤中的表达。方法：将胃肠道粘膜冻干粉碎，CsCl平衡密度离心法提取人胃肠粘蛋白，免疫BALB/c小鼠，取鼠脾细胞与SP2/O-Ag14鼠的骨髓瘤细胞融合成杂交瘤，克隆制备单克隆抗体，并应用LSAB法检测其抗原在胃粘膜、化生粘膜和肿瘤中的表达。结果：制备抗人胃粘蛋白单抗(HGM72,75)和抗人肠粘蛋白单抗(HCM14,21)均为抗粘蛋白糖链抗体。HGM72的抗原表达在胃

2、底腺的颈细胞及胃窦腺细胞。HGM75的抗原表达在胃小凹上皮细胞。HCM14和HCM21的抗原均表达在化生胃粘膜。抗体在肿瘤中表达均较正常低下。结论：人粘蛋白糖链能更好地显示不同的胃粘蛋白糖链表位，作为标记粘蛋白的工具将能够很好地显示胃肿瘤的分化。 关键词单克隆抗体粘蛋白糖链胃肿瘤 中国图书分类号R392-33R735.2 The preparation of monoclonal antibody against human mucin carbohydrates and its usage in the detection of mucin carbohydrates in gastric

3、metaplasia and neoplasm WANG Yue-Zeng，LI Yu-Lin，ZHANG Li-Hong et al （Department of Pathology,Norman Bethune University of Medical Sciences,Changchun 130021） AbstractObjective:To prepare monoclonal antibody specific to gastrointestinal mucin carbohydrates and to detect the mucin carbohydrates express

4、ed in gastric metaplasia and neoplasm.Methods:Human gastrointestinal mucin was extracted from both gastric and intestinal mucosa lyophilized and shattered by using CsCl equilibrium density gradient centrifugation.The splenic lymphocytes from BALB/c mice immunized with the extracts were fused with SP

5、2/0-Ag 14 mouse myeloma cells to produce hybridomas,from which specific monoclonal antibodies were prepared.The expression of mucin carbohydrates in gastric mucosa and neoplasm was determined by an immunohistochemical method.Results:Four of monoclonal antibodies specific to human mucin carbohydrates

6、 were prepared.Two of them were human gastric mucin carbohydrate specific and were named HGM72 and HGM75 respectively.Another two of them were colorectal mucin carbohydrate specific and named HCM14 and HCM21 respectively.The HGM72 specific mucin carbohydrates could be detected in the cells of antral

7、 gland and mucosa neck cells of gastric gland.The HGM75 specific mucin carbohydrates were demonstrated exiting in the gastric foreolar epithelial cells.Both HCM14 and HCM21 specific mucin carbohydrates were found in gastric metaplasia mucosa.In the tumor tissues assayed,mucin carbohydrates specific

8、to four of the monoclonal antibodies could be detected in a lower amount compared with that in normal gastric mucosal tissues.Conclusion:Four of prepared monoclonal antibodies recognizing different epitopes of human gastrointestinal mucin carbohydrates might be used as tools to detect the expression

9、 of different mucin carbohydrates,and therefore to determine the precursor cells from which tumor cells originated. Key wordsMonoclonal antibodyMucin carbohydrateGastric tumor 粘蛋白是上皮细胞产生的粘液的主要成分，被认为是对细胞起着保护和润滑的作用，广泛地存在于消化道。粘蛋白分子在核蛋白上利用O-糖苷键结合了大量的糖链，形成巨大的糖蛋白。其中粘蛋白的糖链可以存在于正常组织和癌组织，但是癌组织中粘蛋白分子的表达较正常组织在

10、各种水平上均有明显的不同。特别是粘蛋白的糖链具有缩短和消失的倾向。本研究新制备了抗胃粘膜和肠粘膜粘蛋白糖链的单抗(HGM和HCM)，并研究胃粘蛋白糖链在早期胃癌，胃粘膜化生及正常粘膜的表达，进一步阐明胃癌的发生起源。 1材料与方法 1.1单克隆抗体的制备取外科手术切除胃肠标本的非肿瘤部分，冻干粉碎，应用CsCl平衡密度离心法，提取胃肠的粘蛋白，作为免疫抗原。根据Kohler和Milstein及Groth等人的方法1，将佐剂乳化过的粘蛋白注入BALB/c小鼠的腹腔内2。将免疫小鼠的脾脏淋巴细胞与SP2/O-Ag14鼠的骨髓瘤细胞相融合，制备杂交瘤，然后用限制稀释方法克隆出系列单抗HGMs和HCM

11、s。 1.2研究材料材料来源于北里大学医学部东病院，外科手术切除的151例胃肿瘤(15例胃腺瘤，136例早期胃腺癌)，胃癌根据Laurén's分级，分为肠型和弥漫型(肠型：77例；弥漫型：59例)，正常胃底、胃窦、不完全肠化生、完全肠化生粘膜各10例。所有材料均经10%福尔马林固定，常规脱水透明石蜡包埋。3 m连续切片，进行粘蛋白糖链免疫组织化学染色及PAS、AB、HID等组织化学染色。 1.3染色方法利用LSAB试剂盒进行免疫组织化学染色，对照使用正常鼠血清替换使用的抗体。 1.4免疫组织化学及组织化学染色的计数各种染色根据其染色细胞阳性率分为04%：0分，5%24%：1分

12、，25%49%：2分，50%74%：3分，75%以上为4分五个范围；根据阳性细胞染色强度分为阴性：0分，弱阳性：1分，中等强度：2分，强阳性：3分四个等级。最后将染色范围和强度的得分相乘即为最后的染色计数(±s)。 1.5统计学处理各种染色计数的比较使用Kruskal-Wallie检验，免疫组织化学染色与组织化学染色的相互关系使用 Spearman等级相关系数，P0.05认为有统计学意义。 2结果 2.1抗人胃粘蛋白单抗(HGMs)人胃粘蛋白免疫的杂交瘤培养上清液与粘蛋白包被的微量滴定板有着显著的结合力。每个阳性的杂交瘤通过限制性稀释的方法而克隆化，克隆所产生的Mab被命名为HGMs

13、，本研究中选择了HGM72和HGM75进行进一步的定性研究。利用胃粘蛋白预处理过的滴定板，通过ELISA方法可以检测到这两种抗体。利用分型试剂盒，HGM72和HGM75的亚型分别被确定为IgM,和IgG,。胰蛋白酶消化处理抗原，不影响每个抗体的反应性，而过碘酸钠的处理却完全破坏了它们之间的结合力(表1)，表明抗体针对的抗原决定簇为粘蛋白的糖链部分3。      表1胃粘液处理后单克隆抗体的反应活性 Tab.1Reactivity of monoclonal antibodies with modified mucins Monoclonal antibo

14、dy Reactivity with modified antigen Trypsin Periodate HGM72 Unaltered Reduced HGM75 Unaltered Reduced HCM14 Unaltered Reduced HCM21 Unaltered Unaltered 2.2抗人肠粘蛋白单抗(HCMs)如同HGMs，利用人肠粘蛋白免疫克隆出的单抗被称为HCMs。本研究选定了HCM14和HCM21，确定其亚型为IgG，胰蛋白酶消化处理抗原也不影响每个抗体的反应性(表1)，而过碘酸钠的处理完全破坏了HCM14与抗原之间的结合力，只部分破坏了HCM21与抗原之间的结

15、合力(表1)。这也说明了HCMs也是针对粘蛋白糖链部分的抗体。 2.3HGM与HCM的抗原在胃粘膜中的表达正常胃粘膜中HGM72的抗原高表达在胃窦腺体的胞浆和胃底腺的颈细胞中(图1A,B)。HGM75的抗原高表达在胃小凹上皮细胞中(图1C)。HCMs的抗原均不表达在正常胃粘膜上。在化生胃粘膜中的杯状细胞中发现部分HCM14的抗原表达。HCM21的抗原表达极少，远远少于5%。HGM75的抗原着色于大部分的杯状细胞及潘氏细胞(图1D)。HGM75和HCM14的抗原尚表达在化生的非分泌的吸收细胞里。 图1HGM72强表达在胃底腺的颈粘液细胞(A；×10)和幽门腺细胞(B；×20)

16、； HGM75表达在胃小凹上皮细胞(C；×25)和化生杯状细胞(D；×25) Fig.1Intense expression of HGM72 in mucous neck cells of the fundic gland area(A；×10) and in pyloric glands(B；×20);Strong HGM75 staining of foreolar epithelial cells(C；×25) and metaplastic goblet cells(D；×25) 2.4HGM与HCM的抗原在胃肿瘤中的表达在

17、胃肿瘤，粘蛋白糖链弥散或集中表达在肿瘤细胞的胞浆和腺腔里。HGM72的抗原在肿瘤的表达明显低于在正常粘膜的表达(P0.000 1)。而在胃腺瘤的表达尚低于两型胃腺癌(P0.01)；HGM75的抗原在肿瘤的表达明显较正常粘膜和肠化生低下(P0.001)，但在胃腺瘤和弥漫型胃癌明显较肠型胃癌表达增高(P0.001)(表2)；HCM14的抗原在胃腺瘤的表达明显较胃癌及肠化生增高(P0.0010.000 1)；HCM21的抗原在胃肿瘤中均表达低下(表2)。 表2胃粘膜、腺瘤、腺癌中HGMs和HCMs的免疫组织化学染色的计数 Tab.2Scores of immunostaining for HGMs

18、and HCMs in gastric mucosa adenomas and adenocarcinomas Normal Metaplasia Adenoma Intestine type Diffused type HGM72 12.0+0.0 - 1.4+0.4 4.4+0.4 5.3+0.5 HGM75 12.0+0.0 Part 8.4+1.1 4.5+0.6 7.5+0.7 HCM14 - 1.1+0.4 7.3+1.1 2.2+0.4 2.8+0.5 HCM21 - 0.4+0.3 0.4+0.5 0.1+0.1 0.1+0.1 2.5抗粘蛋白单抗的表达与组织化学染色的相关性H

19、GM72、HCM21的抗原与PAS和AB个别相关，HGM75的抗原与PAS、AB密切相关，而HCM14的抗原与所有的组织化学染色均相关(表3)。 表3胃腺瘤和胃腺癌中HGMs和HCMs与PAS、AB、HID染色计数的相关性 Tab.3Correlation of staining scores between mucin immunostaining for HCM and HGM series,and histochemistry for periodic acid-Schiff(PAS),Alcian-blue(AB) and high iron diamine(HID) in gastr

20、ic adenomas and adenocarcinomas values by Spearman's correlation coefficients PAS AB HID HCM14 0.380(P=0.004 3) 0.425(P0.000 1) 0.579(P0.000 1) HCM21 NS 0.557(P=0.018 8) NS HGM72 0.224(P=0.024 2) NS NS HGM75 0.330(P=0.000 5) 0.269(P=0.020 5) NS Note:NS，not significant 3讨论 粘蛋白是上皮细胞产生的主要成分，对细胞起着保护

21、和润滑的作用。不仅在消化道，还在气管上皮、唾液腺、颌下腺、腮腺、膀胱、乳腺、子宫、卵巢及前列腺等的上皮细胞存在。到目前为止，至少已有8种粘蛋白的核蛋白的基因序列已被克隆，按被克隆出来的顺序分别被命名为MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5AC、MUC5B、MUC6和MUC74。因为这些核蛋白混合存在于上皮细胞分泌的粘液中。故利用这些标记工具不能很好地区分粘液的成分5。利用组织化学染色：PAS、AB、HID以及刀豆蛋白A、半乳糖氧化酶染色等技术将人胃肠粘液常规分类为中性粘蛋白、唾液粘蛋白和硫基粘蛋白。然而，这些技术对于复合的粘蛋白来说亦只能检测到粘蛋白的一部分内容6。粘蛋白中糖链占全分

22、子量的50%以上，有时可达80%7。单聚糖以O-糖苷键结合在核蛋白的侧链，并以共价键互相结合，形成分子量数百万的巨大分子8。分子内含有大量的水分，形成胶体，覆盖在粘膜表面。在消化道粘蛋白具有防止胃酸及消化酶的作用，以及抵抗细菌的损伤，保护组织的作用。从粘蛋白的分子结构和机能来看，糖链在粘蛋白中有着重要的作用9。 本研究针对粘蛋白糖链制备了抗人胃肠粘蛋白单抗HGM72、75和HGM14、21。检测证明HGM72、75和HGM14的抗原决定簇都是从粘蛋白侧链的一个低聚糖混合物获得的。经过免疫组织化学染色，我们发现在正常胃粘膜其抗原存在的部位是不同的。HGM72的抗原表达在胃底腺的颈粘液细胞和胃窦腺

23、细胞，而HGM75广泛着色于胃小凹上皮细胞，肠化生的杯状细胞和非分泌的吸收细胞。HCM14的抗原仅表达在肠化生的粘膜细胞。根据这些抗原的免疫反应把胃肿瘤细胞的分化分为三型：颈粘液细胞或胃窦腺细胞型(胃粘液细胞型)；胃小凹上皮细胞型(胃小凹细胞型)；杯状细胞或非分泌细胞型(肠显型)。 在胃腺瘤，我们发现HGM75和HCM14的抗原高表达，而HGM72的抗原低表达，其显示的细胞分化为肠显型；在肠型和弥漫型两型胃癌中HGM75和HCM14的抗原均低表达，而HGM72的抗原高表达，弥漫型胃癌以胃小凹上皮细胞显型占优势，肠型胃癌以胃小凹上皮和粘液细胞为主。由此来看，胃腺瘤和胃癌的分化类型是不同的，可推断

24、胃癌是不可能由胃腺瘤恶变而来的。 Tatematsu等人利用粘蛋白的组织化学染色及胃蛋白酶原免疫组织化学染色将胃癌分为胃型：包括颈粘液细胞、胃窦腺细胞和表面粘液细胞；肠型：包括杯状细胞和吸收细胞。它们的研究表明高分化细胞癌主要包括胃型和肠型细胞，低分化细胞癌主要是胃显型的细胞。我们目前研究的低分化细胞癌是胃小凹上皮细胞型占优势，支持对于低分化细胞癌(弥漫型)分类的结论，而高分化细胞癌(肠型)是胃小凹上皮和粘液细胞型为主，所以高分化细胞癌(肠型)的分类尚有待于我们进一步的研究。      这些粘蛋白糖链的表达还与组织化学染色有一定的相关性。因此这些抗体的免

25、疫组织化学染色与组织化学染色联合应用能够很好地显示胃肿瘤的分化和早期癌变时粘蛋白糖链的改变，是标记粘蛋白非常有意义的一个工具。 (编辑张慧) 作者简介：王悦增，男，33岁，讲师，博士，主要研究肿瘤间质血管； 李玉林，男，50岁，教授，博士生导师，主要研究肿瘤间质血管 王悦增（白求恩医科大学病理教研室，长春 130021） 李玉林（白求恩医科大学病理教研室，长春 130021） 张丽红（白求恩医科大学病理教研室，长春 130021） 三富弘之（北里大学医学部病理教室） 冈安粆（北里大学医学部病理教室） 参考文献 1，Ishihara K,Kurihara M,Eto H et al.A mono

26、clonal antibody against carbohydrate moiety of rat gastric surface epithelial cell-derived mucin.Hybridoma,1993；12:609 2，Kim Y S,Gum Jr J R.Diversity of mucin genes,struction,function,and expression.Gastroenterology,1995;109:999 3，Ishihara K,Kurihara M,Goso Y et al.Establishment of monoclonal antibodies against carbohydrate moiety of gastric mucins distributed in the different sites and layers of rat gastric mucosa.Glycoconjugate J,1996;13:857 4，Gendler S J,Spicer A P.Epithelial mucin genes.Annu Rev Physiol,1995;57:607 5，Neutra M R,Forstner J F.Gastrointestinal mucus:Sy