蛋白质工程在苏云金芽胞杆菌Cry毒素改良中的应用

1、中国农业科技导报,2010,12(4):24-28JournalofAgriculturalScienceandTechnology蛋白质工程在苏云金芽胞杆菌Cry毒素改良中的应用刘 明1,2, 束长龙, 高继国, 张 杰212(1.东北农业大学生命科学学院,哈尔滨150030;2.中国农业科学院植物保护研究所,植物病虫害生物学国家重点实验室,北京100193)中图分类号:Q816 文献标识码:A 文章编号:1008 0864(2010)04 0024 05UtilizationofProteinEngineeringinImprovingCryToxinsinBacillusthuringi

2、ensisLIUMing,SHUChang long,GAOJi guo,ZHANGJie1,222(1.CollegeofLifeSciences,NortheastAgriculturalUniversity,Harbin150030;2.StateKeyLaboratoryforBiologyofPlantDiseasesandInsectPests,InstituteofPlantProtection,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100193,China)Abstract:MicrobialpesticideofBacillu

3、sthuringiensisandtransgeniccropswithcrygeneshavebeenprovedagreatsuccessworldwidely,whiletheapplicationofBtinagriculturalproductioninthefuturewillbelimitedduetosomeflaws,suchasnarrowinsecticidalspectrumofcrystalproteins,lowtoxicityandinsectsresistantriskagainstCrytoxin.Proteinengineeringincludingrati

4、onaldesigningandnon rationaldesigninghavebeenusedtoimprovecrystalproteins,aimingatsolvingtheabovementionedproblems.ThispapersummarizedtheprogressmadeinapplicationofproteinengineeringinCrytoxinimprovement,analyzedtheexistingproblems,andprospectedthetrendforfuturedevelopment.Keywords:proteinengineerin

5、g;Bacillusthuringiensis;rationaldesign;non rationaldesign苏云金芽胞杆菌(Bacillusthuringiensis,简称Bt)是一种需氧的革兰氏阳性土壤细菌,在芽胞期能产生对多种害虫具有毒性的杀虫晶体蛋白,称作Cry毒素1-2009年间,Bt杀虫蛋白基因命名委员会公布的新cry(含cyt)基因有304个,年均33.8个;而同源性低于90%、可以直接申请专利保护的模式基因(holo type)只有101个,年均11.2个(图1)3。自1996年转Btcry基因抗虫棉。产业化以来,全球转基因植物的种植面积逐年增2加,2009年,种植面积达到

6、1.34亿hm,比2008年增加了7%,其中转Btcry基因抗虫性状占30%。由于Bt在微生物杀虫剂和转基因植物应用中的巨大潜力,有关高毒力和新型杀虫活性的cry基因的分离克隆以及对现有的Cry毒素的改造已成为近年来国内外Bt研究的热点。20012可见,从自然界中分离克隆得到对害虫具有高毒力的新型Btcry基因难度正在不断增加。因此,通过分子设计、蛋白质工程等新的技术对现有Cry毒素进行改造,使之发挥更大的作用是不少4研发单位新的研究目标。运用定点突变、loop与结构域互换、定向进化等新的分子设计技术对Cry毒素进行改良,将能收稿日期:2010 04 06;修回日期:2010 04 07基金项

7、目:国家973计划项目(2009CB118902);国家863计划项目(2006AA10A212)资助。作者简介:刘明,硕士研究生,主要从事Bt杀虫基因分子设计研究。E mai:lliuming_84。通讯作者:张杰,研究员,主要4期刘明等:蛋白质工程在苏云金芽胞杆菌Cry毒素改良中的应用1325Cry8Ea等杀虫蛋白晶体的三级结构已相继被解析,尽管这些Cry毒素的氨基酸和杀虫特异性大不相同,但是它们都是由3个非常相似的结构14,15域(Domain)组成。这些晶体结构的解析,为Cry毒素的分子设计创造了有利条件。在研究Cry毒素作用机理的同时,研究者希望通过理性设计对其进行改良,以达到提高蛋

8、白质毒性、扩大杀虫谱等目的。17Wu等研究了结构域 在孔洞形成中的作用,对Cry1Ac 5上168位组氨酸进行定点突变,产生的突变体(H168R)对烟草天蛾(Manduca18sexta)的毒性提高了3倍;Angsuthanasombat等对Cry4B中定位于 4、 5之间203位精氨酸的蛋白质酶裂解位点进行定点突变,获得了对埃及伊蚊(Aedesaegypti)的毒性增加3倍的突变体(R203A);根据Bt的Cry毒素与大肠杆菌素A亚族、白喉毒素的B亚族、假单胞菌外毒素在孔道1920形成时非常相似的特征,Chandra等用白312319喉毒素 7上8个氨基酸(SSDSIGVL)替换Cry1Ac

9、上的8个氨基酸(VLDIVALF),产生的突变体对棉铃虫(Helicoverpaarmigera)的活性21较原始Cry蛋白提高了8倍;Bah等通过分析胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶位点突变对Cry1Aa毒性与稳定性的影响,发现178位氨基酸残基的突变(F178S)会使该蛋白对云杉卷叶蛾(Choristo22neurafumiferana)的毒力提高2倍;Mandal等删除了Cry2AaN端的42个氨基酸,导致其对海灰翅夜蛾(Spodopteralittoralis)、小地老虎(Agrotisipsilon)的毒力增加了3倍;另外,在Cry2A的N端删除42个氨基酸的基础上引入2个点突变(K63F、K

10、64P)可使得其毒性提高到6倍。23Sober n等在研究应对昆虫抗性的问题时发现,将Cry1A毒素钙粘蛋白进行删除后,获得的突变体Cry1AbMod和Cry1AcMod对抗性红铃虫(Pectinophoragossypiella)具有明显的毒性。任羽24等将Cry1Ca7中分别位于 4、 5与 6上的148、177位氨基酸残基定点突变,获得的突变体对甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)的毒性分别提高2522402478,16图1 全球分离克隆的苏云金芽胞杆菌cry基因数量Fig.1 ThenumberofcrygenesclonedfromBacillusthuringiensisi

11、ntheglobe.充分发挥这些已知的cry基因的潜力。Cry毒素的分子设计和改良,大部分的专利(超过450个)主要集中在美国。从近几年发表文章的数量来看,在Cry毒素的改良中,定点突变和结构域互换的理性设计占99%左右(超过600篇),并已取得较好的成果,目标蛋白主要集中在Cry1、Cry2、Cry3、Cry4和Cry8等;而随机突变和基因重组等非理性设计仅占1%左右(不超过10篇)。自2000年以来,国内在新型苏云金芽胞杆菌杀虫基因发掘方面取得了长足的进步,已经获得了150余种cry基因,但是模式基因只有38个,并且部分新基因的杀虫活性目前尚未明确。中国国内单位申请的Bt及其杀虫基因专利不

12、足40项,而有关Cry蛋白分子设计与改良的专利至今还是空白。本文通过对理性设计与非理性设计在Cry毒素中的应用、取得的研究成果等方面进行总结分析,旨在为国内研究者对Cry毒素的分子设计、改造和利用提供参考和借鉴。1 理性设计理性设计主要是围绕蛋白质的结构和功能等信息展开的,通过对氨基酸序列中要突变的位点进行精确设计并利用定点突变技术,在已知DNA序列中替换、插入或缺失特定核苷酸,以达到改变蛋白质分子中特定氨基酸的目的。近年来,通过56,78X 射线技术,Cry1Aa、Cry1Ac、Cry2Aa、C910111226中国农业科技导报12卷8,16的特异性结合。Rajamohan等发现,用丙氨酸或

13、甘氨酸替换Cry1Ab蛋白loop2上第372位的天冬酰胺残基后,获得的突变体对舞毒蛾(Lymantreadispar)幼虫毒性提高了8倍,而与原始的Cry1Ab相比,位于 8和loop2上突变体DF 1(A282G、L283S和N372A)对舞毒蛾幼虫的毒性增加了36倍;Lee等为了研究Cry1Abloop上的氨基酸残基与受体结合及活性的关系,将位于Cry1Ab中第282位、第283位残基上的丙氨酸和亮氨酸用甘氨酸和丝氨酸取代,获得了对舞毒蛾毒力高了7倍的28突变体;Wu等将Cry3A蛋白loop3上的片段用丙氨酸替换,产生的多突变体QGSR AAAA481486318,16中具有不同的功能

14、。Lee等研究了Cry1Ac中Domain在毒素503504等50650852252352452551332304824852726变对Cry1Aa毒性与稳定性的影响,发现突变体F576S对云杉卷叶蛾的毒力提高4倍,突变体R543S、R566G、F570S对云杉卷叶蛾的毒力均提高2倍,双突变R543S+F576C对云杉卷叶蛾的33毒力提高2倍;Xiang等在分析突变体活性改变的机制时,得到了一个位于Cry1Ac5蛋白在 18 19之间的突变体N546A,对棉铃虫的毒力提高了1.78倍。1.2 结构域互换除了定点突变外,进行结构域替换,也是获得广谱高毒杀虫基因的一种手段。构建的杂合基因不仅保持了

15、原有的杀虫活性,也对原本无杀虫活34性的昆虫表现出毒性。例如,Malvar等将Cry1A与Cry1F融合在一起构建的杂合基因,保持并提高了对鳞翅目、双翅目害虫的杀虫活性。deMaagd35等将Cry1Ca的Domain与Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1Ba和Cry1Ea的Domain互换,发现后面这些基因都获得了对甜菜夜蛾的杀虫活性。2 非理性设计与理性设计相比,非理性设计(又称定向进化)是在不需要了解有关蛋白质结构与功能之间的关系等信息的情况下,通过对编码氨基酸的基因进行随机突变和重组来构建突变文库,然后结3638合高通量的手段进行定向筛选。苏云金芽胞杆菌Cry毒素定向进化采用的方法主要

16、分为随机突变和基因重组。2.1 随机突变易错PCR(error pronePCR)是随机突变中最常用的方法,主要是利用TaqDNA聚合酶来增加错误碱基渗入的机率,导致目的基因随机突变。39Kumar等通过对Cry1Ac的随机突变,获得对烟草天蛾和烟芽夜蛾毒力提高3倍的突变体40(F134L);Shu等利用易错PCR建立了Cry8Ca随机突变文库,并对文库进行活性筛选,最终获得的M100(E642G)和M102(Q439P、E884G)2株突变体对铜绿金龟子(Anomalacorpulenta)活性分别提高了4倍和4.5倍,并指出低突变率更易获得4活性提高的Cry毒素。Ishikawa等将噬菌体

17、展示技术应用于Cry毒素突变文库的筛选中,并与定向进化相结合,获得的Cry1Aa突变体(R5 51)对家蚕(Bombyxmori)活性提高了4倍。本实验4期刘明等:蛋白质工程在苏云金芽胞杆菌Cry毒素改良中的应用27活性筛选,也得到12株对小菜蛾(Plutellaxylos tella)活性不同程度提高的突变体(未发表资料)。2.2 基因重组在定向进化方面,最为突出的方法的就是基因重组,DNAshuffling作为基因重组中应用最多的方法,它克服了随机突变的随机性较大的限制,能够直接将多条基因的有利突变直接重组到一41,4243起。Craveiro等借助该方法对Cry1Ia12进行定向进化,C

18、ry1Ia12原本对甘蔗大螟(Telchinlicuslicus)没有活性,结合噬菌体展示技术对重组文库进行定向筛选后,获得了4个对甘蔗大螟有活性的突变体,从而扩大了Cry1Ia12蛋白的杀虫谱。综上所述,随着高通量筛选和体外展示技术的发展,一些原本操作起来耗时耗力和难以进行直接筛选的Cry毒素也能够得到有效的改造,这为Cry毒素的遗传改良又开辟了一条新的途径。谱、高毒的Cry毒素的进程。随着生物信息学、蛋白质工程技术和高通量筛选技术的迅速发展,定向进化将不仅成为改良Cry毒素的一个有效快捷的手段,而且将大大加快Cry毒素进化的速度与质量,为微生物杀虫剂和转基因植物提供更有价值的重组基因。参

19、考 文 献1 SchnepfE,CrickmoreN,VanRieJ,etal.Bacillusthuring2 JamesC.GlobalStatusofCommercializedBiotech/GMCrops:2009R.ISAAABrief41,2009.3 CrickmoreN.BacillusthuringiensistoxinnomenclatureEB/4 IshikawaH,HoshinoY,MotokiY,etal.AsystemfortheBorisovaM,etal.BacillusthuringiensisCryIA(a)insecticidaltoxin:cryst

20、alstructureand6 DerbyshireDJ,EllarDJ,LiJ.CrystallizationoftheBacillusDerbyshireDJ,PromdonkoyB,etal.Structural8 MorseRJ,YamamotoT,StroudRM.StructureofCry2AasuggestsanunexpectedreceptorbindingepitopeJ.Structure(Cambridge),2001,9(5):409-417.9 LiJD,CarrollJ,EllarDJ.Crystalstructureofinsecticidaldelta en

21、dotoxinfromBacillusthuringiensisat2.5AresolutionJ.Nature,1991,353(6347):815-821.10 GalitskyNV,CodyA,WojtczakD,etal.Structureoftheinsecticidalbacterial endotoxinCry3Bb1ofBacillusthuringien11 BoonsermP,MoM,AngsuthanasombatC,etal.StructureofthefunctionalformofthemosquitolarvicidalCry4AatoxinfromBacillu

22、sthuringiensisata2.8 angstromresolutionJ.Bacterio.l,2006,188(9):3391-3401.12 BoonsermP,DavisP,EllarDJ,etal.Crystalstructureofthemosquito larvicidaltoxinCry4Baanditsbiologicalimplications13 GuoS,YeS,LiuY,etal.CrystalstructureofBtCry8Ea1:Aninsecticidaltoxintoxictoundergroundpests,thelarvaeofsishasevol

23、vedspecifictoxinstocolonizetheinsectworldJ.,199.J.D,2001,57(8):11013 展望Bt微生物制剂和转基因抗虫作物已经在全球范围内取得了巨大成功,但是Cry蛋白存在杀虫谱窄、毒力有限以及害虫对Bt毒素的抗性风险上升等问题,制约着Bt在未来农业生产中进一步发挥巨大作用。目前,已有部分Cry毒素成功进行了蛋白质工程改造(例如专利US6962705、US2008047034等),解决了Bt在实际应用过程中45遇到的这些问题。理性设计正是基于在掌握Cry毒素三维结构及相关功能的基础上,通过定点突变和结构域互换,可以使晶体蛋白在原有毒力的基础上提

24、高毒力或扩大杀虫谱。但是,理性设计研究的弊端就是工作量大,需要消耗大量的人力与物力,并且获得活性提高的Cry毒素的机率并不高,而定向进化等非理性设计恰好与之互补。目前,定向进化作为蛋白质工程一个重要的技术平台正得到日益广泛的应用,并且已经在酶工程改造方面取得成功。这也为Cry毒素的改良提供了重要的参考和借鉴。现在,提高突变体库容量和质量的定向进化方法越来越多,定向筛选技术也不断发展,这将增加Cry毒素遗传改良的成功率。尤其是在已知的Cry蛋白结构与功能关系的基础上,结合理性的非理性设计,将随机突变或重组集中在少数特4428中国农业科技导报mutagenesisinareceptorbindin

25、gloopJ.2000,473(2):227-232.12卷FEBSLett.,15 PigottCR,EllarDJ.RoleofreceptorsinBacillusthuringiensis16 GrochulskiP,MassonL,BorisovaS,etal.BacillusthuringtheBacillusthuringiensisdelta endotoxininvolvedintoxicityandspecificityJ.-2317.Bio.JlChem.,1992,267(4):231130 AbdullahMA,AlzateO,MohammadM,etal.Intro

26、ductionofCulextoxicityintoBacillusthuringiensisCry4Babyprotein31 RohJY,NairMS,LiuXS,etal.MutagenicanalysisofputativedomainIIandsurfaceresiduesinmosquitocidalBacillusthuringiensisCry19AatoxinJ.Lett.,2009,295(2):156-163.FEMSMicrobio.l18 AngsuthanasombatC,CrickmoreN,EllarDJ.Effectsoninwater:acommonpack

27、ingmotifinbacterialproteintoxinssubstitutioninalpha helix7ofCry1Acdelta endotoxinofBacillusthuringiensisleadstoenhancedtoxicitytoHelicoverpaarmigeraHubnerJ.FEBSLett.,1999,458(2):175-179.21 BahA,vanFrankenhuyzenK,BrousseauR,etal.TheGayenS,BasuA,etal.Predictionbased23 Sober nM,Pardo L pezL,L pezI,etal

28、.EngineeringmodifiedBttoxinstocounterinsectresistanceJ.Science,2007,318(5856):1640-1642.24 任羽,刘华梅,宋福平,等.苏云金芽胞杆菌CrylCa7蛋白定点突变对甜菜夜蛾杀虫活性的影响J.微生物学报,2008,48(6):733-738.25 WaltersFS,StacyCM,LeeMK,etal.Anengineeredchy27 LeeMK,YouTH,CurtissA,etal.InvolvementoftwoaminoacidresiduesintheloopregionofBacillusthu

29、ringiensisCry1AbtoxinintoxicityandbindingtoLymantriadisparJ.Biochem.-146.28 WuSJ,DeanDH.FunctionalsignificanceofloopsinthereBacillusthuringiensisCry3Adelta endotoxinincoleopteransbyBiophys.Res.Commun.,1996,229(1):139J.32 LeeMK,YouTH,GouldFL,etal.Identificationofresi33 XiangWF,QiuXL,ZhiDX,etal.N546inbeta18 beta19loopisimportantforbindingandtoxicityoftheBacillusthuringiensisCry1ActoxinJ.J.101