广西菲牛蛭提取物抗动物血栓形成的作用

1、广西菲牛蛭提取物抗动物血栓形成的作用水蛭是我国传统中药，主要用于治疗痞块、血瘀、闭经和跌打损伤。广西菲牛蛭唾液腺分泌物亦富含菲牛蛭素、纤溶酶、透明质酸酶血管扩张剂等多种肽类物质。本实验室采用离子交换和凝胶过滤等方法从广西菲牛蛭中分离纯化出富含菲牛蛭素、纤溶酶的提取物并利用该提取物研究抗动物血栓效应，以期开发新型的抗血栓生物制剂。1材料与方法1.1 药物：菲牛蛭提取物(100ATU/ml),由广西医科大学蛇毒研究所提供。1.2 动物：家兔，体重1.82.5kg；SD大鼠，体重200300g；动物雌雄兼用，均为清洁级，由广西医科大学实验动物中心提供。1.3 试剂和仪器：戊巴比妥钠、枸檬酸钠、电子天

2、平、秒表。体外血栓形成仪：按Chandler氏体外血栓形成装置,蠕动泵改装的泵轴装一个有机玻璃盘，有内径4 mill、长250 mill、半径38 mm的聚氯乙烯管环,固定盘上,管环平面与地平夹角为74。，管环内可盛血液，整个仪器置于自动控温培养箱中。1.4 实验方法1.4.1 家兔体外血栓形成实验：取家兔32只，随机分为4组，每组8只，各兔静脉注射1戊巴比妥钠(30mg/kg)麻醉。分离家兔股动脉，取血1ml注入聚乙烯管中，各给药组(L5、0.75、0.5ATU3个剂量组)在管中注入0.2ml菲牛蛭提取物，对照组注人相同体积生理盐水，按Chandler氏法，使血液在37条件下以16/rnin

3、的速度在体外血栓形成仪上旋转10min,制备血栓。用滤纸吸干血栓水分，称取血栓湿重，湿血栓自然风干6h,为干血栓。1.4.2 大鼠血栓形成实验：以60ATU/kg剂量菲牛蛭提取物股静脉注射SD大鼠，分别于给药前、给药后5、10、15min从腹主动脉抽血1ml,按上述Chandler氏改良法制备血栓，观察水蛭素对血栓形成的抑制作用。1.4.3 大鼠静脉血栓形成实验：采用Reyers法改良制备大鼠静脉血栓模型，取大鼠10只，随机分成2组(水蛭素提取物60ATU/kg组和生理盐水对照组)，每组5只，腹腔注射1%戊巴比妥钠(30mg/kg)麻醉后，开腹分离下腔静脉，于左肾下方用线结扎，给药组由静脉注射

4、水蛭素，对照组给予等量生理盐水，20min于结扎处下方2cm处结扎血管，阻断血流，2h后，纵行剖开下腔静脉取出血栓，称湿重，风干6h称干重。1.4.4 家兔动脉血栓形成实验：采用Teruhiko法制备家兔动脉血栓模型，取家兔6只，注射1%戊巴比妥钠(30mg/kg)麻醉，分离左侧的颈总动脉和右侧的颈外静脉，在7cm的聚乙烯管中放一根预先称重的4号手术线。以3.8的枸檬酸钠浸润管壁后插入左颈动脉和右颈静脉之间，术后开放血流后15min,取出手术线称重，减去原线重量即为药前血栓湿重。然后静脉注射菲牛蛭提取物，于给药后15、30、45、60min分别测定聚乙烯管中手术线重量，减去原线重量，即得药后不

5、同时段的血栓湿重，风干6h,称血栓干重。并计算抑制率抑制率=(对照组血栓重量给药组血栓重量)/对照组血栓重量x100o1.4.5 统计学处理：实验数据采用成组设计方差分析处理，各项指标均以(x±S)表示。2结果2.1菲牛蛭提取物对家兔体外血栓形成的影响：大、中剂量组与对照组相比，菲牛蛭提取物对家兔体外血栓形成比较，差异有统计学意义(P<0.05),血栓抑制率为24.3100%o小剂量组与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)见表lo表1菲牛蛭提取物对家兔体外血栓形成的影响(x±s,n=8)组别TAU剂量八里(m/mg)湿重抑制率干重(%)干重抑制率(%)(m

6、/mg)对照组39.39±5.877.91±1.31大剂量组1.50*±01000*±0100中剂量组0.7525.76±2.67*34.66.01±1.02*24.3小剂量组0.536.55±7.907.27.47±2.295.6注：与对照组相比，*P<0.01*P<0.052.2菲牛蛭提取物对大白鼠血栓形成的影响：与对照组比较，给药组药后5min对大白鼠半体内血栓形成影响不大(P>0.05),药后10、15min对大白鼠半体内血栓形成影响差异有统计学意义(P<0.05),血栓的湿重明显减

7、小或完全消失(见表2)o表2菲牛蛭提取物对大鼠血栓形成的影响(x±s,n=5)组别剂量(ATU/kg)药后血栓湿重(m/mg)5minlOmin15min对照组12.69±3.04 12.84 ±3.71 11.92± 2.58给药组 60 13.45注：与对照组相*±3.957.68±2.86*0±0*P<0.014P<0.05比，2.3菲牛蛭提取物对大鼠静脉血栓形成的影响(见表3)：表3菲牛蛭提取物对大鼠静脉血栓形成的影响(x±s,n=5)组别剂量(ATU/kg)血栓湿重(m/mg)血栓干重(m/m

8、g)血栓形成率(%)对照组7.72±3.72.46±1.26100给药组600*±00±0*0注：与对照组相比，*P<0.01z*P<0.05表3可见，大白鼠静注菲牛蛭提取物60ATU/kg后，大鼠静脉血栓形成率为0,血栓干湿重为0,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)o2.4菲牛蛭提取物对家兔动脉血栓的溶栓效应(见表4、5)o表4菲牛蛭提取物对家兔动脉血栓湿重的影响(X±s,n=6)剂量药前药后ATU/kg(m/mg)15min30min45min60min6030.25±6.7920.69±6.

9、74*17.56±4.87*19.88±5.34*26.72±9.64抑制率-30.942.034.311.7注：药后与药前相比，><0.05表5菲牛蛭提取物对家兔动脉血栓干重的影响-±s,n=5)剂量药前药后(m/mg)ATU/kg(m/mg)15min30min45min60min±1.63607.18±1.574.98±1.554.06±1.02*4.38±0.60*5.88抑制率30,6 43.438,9 18.1注：药后与药前相比，*P<0.05由以上结果表明，60ATU/kg

10、菲牛蛭提取物对大鼠静脉血栓形成有完全抑制作用，为高剂量组，而对于家兔动脉血栓形成抑制率在30%40%之间，属中剂量组。给药组与对照组比较，可明显减轻家兔动脉血栓和大鼠静脉血栓重量，且未见异常反应和出血。3讨论血栓性疾病是一种严重威胁人类健康的疾病，探索预防和治疗血栓性疾病的药物显得十分重要。抗血小板功能抑制剂和抗凝剂是抗栓治疗的有效办法。肝素和华法林在抗凝治疗中已应用了数十年，目前仍是临床上治疗各种血栓栓塞的常用药物。但由于这两种药物仍有许多局限性，据报道，3%的病人在使用肝素5d后会出现由肝素引起的血小板减少症。科学家正在广泛寻求新药，以提高疗效和安全性。诱导管内血栓形成的因素有很多种，但根

11、本因素是血液凝固、血小板黏和聚集。静脉血栓形成主要由于血液凝固，动脉血栓形成则主要是小板在动脉中黏附和聚集。血小板聚集性过高是促使心血管疾病发展的重要因素。凝血酶在凝血过程中起着至关重要的作用；使纤维蛋白原变成纤维蛋白，最终使凝块形成。凝血酶也是引起血小板聚集的最主要激活剂之一。由于凝血酶在血液凝固过程及血小板激活过程中具有双重作用，近年来对凝血酶抑制剂的研究特别受到重视。抑制血栓的形成一般有3条途径：一是促进纤溶系统对纤维蛋白原或纤维蛋白的降解；二是抑制凝血功能；三则是抑制血小板的聚集、黏附、释放功能。体内外试验表明：水蛭素是迄今发现的作用最强的凝血酶抑制剂，对各种血栓性疾病都有效。水蛭素作用机制是它与凝血酶按1：1比例非共价结合形成一种稳定的复合物，抑制了凝血酶的活性，阻止纤维蛋白原及凝血酶对血小板的作用，达到抗凝目的。水蛭素在常温干燥状态下比较稳定，其作用不依赖于ATIII等血浆辅助因子，其抑制血栓形成的浓度远小于其引起出血的浓度，无明显毒副作用。动物性试