两个新的水稻缺叶绿素b突变体光合作用的热稳定性

1、中国科学 C 辑 生命科学 2004, 34 (5: 395401 395两个新的水稻缺叶绿素b 突变体光合作用的*热稳定性林植芳*彭长连 徐信兰 林桂珠 张景六国家植物分子遗传重点实验室, 上海 200032( 中国科学院华南植物研究所, 广州 510650; 中国科学院上海生命科学院 植物生理生态研究所摘要 两个新的缺叶绿素b 的水稻突变体VG28-1, VG30-5及其野生型品种中花11号的叶片用28, 36, 40, 44和48等温度于暗处理30 min或以0.5/min的速率从30逐步升温至80. 光合机构的热稳定性通过叶绿素荧光参数、光合速率、色素含量、叶绿体超微结构和H 2O 2

2、累积的组织定位等的变化给予估测. 缺叶绿素b 的突变体与野生型之间的Fo-温度响应曲线的格式有差别, 且突变体Fo 快速升高的温度折点(48 比野生型(51 低3. 温度升至45 时, 突变体的叶绿体肿胀, 基粒类囊体开始模糊并失去光合放氧能力, 但野生型的叶绿体超微结构仍无明显的变化. 55处理后两个突变体的类囊体结构紊乱, 叶片中的H 2O 2明显累积, 野生型中H 2O 2量少, 膨大的类囊体仍保持一定的垛叠结构. 与野生型相比, 高温处理过程中突变体的qP, NPQ和Fv/Fm的较大变化与其Pn 下降速率相近. 这些结果表明缺叶绿素b 的突变体对高温敏感, LHC 中缺叶绿素b 可能导

3、致较低的PS 结构与功能的热稳定性, 光合机构的热损伤可能部分归因于在重度高温条件下产生的氧化胁迫.关键词 水稻 热稳定性 缺叶绿素b 的突变体 叶绿体超微结构 叶绿素荧光 H 2O 2温度是影响光合机构的形成与功能的主要环境因子之一1. 由于植物的热稳定性不同, 温度也影响其种类和基因型的分布及产量. 夏季田间经常出现3238的中等高温, 近年来全球气候变化引起气温显著升高, 尤其是2003年一些地区的温度已高达42, 这些情况下植物将遭遇到重度的高温胁迫.光合作用是植物细胞中对热最敏感的反应3, 光2004-08-09收稿* 国家重点基础研究和发展计划项目(批准号: G1999011601

4、、中国科学院知识创新前沿领域项目华南植物研究所所长基金资助 *E-mail:合机构中类囊体膜的组分最易受到热胁迫的伤害46. 高温对PS 功能的影响有多种表现, 其差别取决于被研究的植物材料的多样性, 因此, 利用各种植物材料来研究热稳定性的不同特点将有助于增加人们对光合机构耐热性和热伤害机制的认识.缺少叶绿素b 的突变体是近年来用于研究叶绿素合成机制和叶绿素b 在类囊体膜的捕光色素蛋白复合396中国科学 C 辑 生命科学第34卷体装配中作用的重要材料, 有报告指出生长于17和26的甜三叶草(Melilotus alba 含低水平叶绿素突变体是热敏感的. 缺乏叶绿素b 的大麦突变体Chlori

5、na -f 2显著减弱PS 的热稳定性. 然而据我们所知, 目前尚未有检测低叶绿素b 或缺叶绿素b 的水稻突变体热稳定性方面的报道.两个新的缺Chl b 水稻突变体VG28-1和VG30-5是近年从插入玉米转座子的转基因水稻9在组织培养过程中筛选出来的. 我们先前的研究看出此两个突变体的基本光合特性与其他缺Chl b 植物有一定的差别, 如具有较高的Rubisco 蛋白含量、较大的以叶绿素为基数表示的叶黄素循环库及CPI 在77K 荧光发射的明显蓝移现象等. 本文的目的在于比较野生型和两种新的缺Chl b 突变体之间的光合机构热稳定性, 以探讨水稻缺Chl b 后热敏感性的变化, 以及热对水稻

6、光合机构损伤的原因是否包括活性氧的介导作用.子传递的量子产额PS , 光化学猝灭qP, 非光化学猝灭NPQ 按Maxwell 等人13的方法计算, 非光化学猝灭F/Fm. 叶绿素荧光参数的命的产额Y N 为(F/Fm名主要参照Van Kooten等人. 文中的相关数据是34个样品重复测定的均值.Fo-温度(F-T曲线是将叶片置于3080中以0.5/min连续升温而测定相应的Fo, 记录Fo 快速升高的折点温度和Fo 达最高水平时的温度.1.4 叶片中H 2O 2的检测叶片用0.2 mg/mL的2-氨基联苯胺(DAB, dia-minobenzidine + 0.01%Triton X-100的

7、溶液真空渗入30 min, 随后放置24 h. 被染色的叶片用蒸馏水洗涤并在煮沸的乙醇中回流10 min以除去光合色素. 叶片的红棕色H 2O 2-DAB 复合物在显微镜(Olympus SZX 12下观察拍照.1 材料与方法1.1 植物材料和温度处理水稻野生型品种中花11号和两个缺Chl b 突变体VG28-1, VG30-5的种子于25发芽后播于室外的盆中. 幼苗生长期的平均光强约700 µmol/(m·s, 白天最高温度2530. 幼苗6叶期时取刚完全展开的成熟叶片为材料, 将叶片中部切段放入蒸馏水中分别置于3648的控温水浴中, 暗处理30 min, 以28处理的叶

8、片作对照.21.5 叶绿体超微结构将叶片中部切成小片(6 mm×1 mm用4%戊二醛和1%锇酸固定, 系列乙醇溶液脱水, EP812树脂包埋. 超薄切片(Reichert Uetracut S, Germany后, 加2%乙酸双氧铀及6%柠檬酸铅染色. 叶绿体超微结构用透射电子显微镜(JEM-1010, Japan观察.2 结果2.1 叶绿素含量和光合速率在2840范围内, 两个新的缺Chl b 突变体的光合放氧速率低于野生型(P < 0.05, 3种供试水稻表型的光合放氧速率随温度从28升到40而明显降低(图1(a, 温度高于42则完全失去放氧活性, 这与马铃薯叶片在42时没

9、有光合放氧能力的结果相似2. 两种缺Chl b 突变体在4448时的放氧负值与野生型接近.升高温度也导致叶绿素含量的降低, 野生型水稻的总Chl (Chla + Chlb 含量经48处理后比28时减少了24%, 而两种突变体的Chl a 则降低20% 22% (图1(b, 结果表明光合放氧对高温的敏感性大于叶绿素含量, 这意味着高温下光合速率的下降主要不是由于较低的捕光能力之故.1.2 光合速率和叶绿素含量光合放氧速率用叶圆片氧电极(Leaf Lab 2, Han- satech, UK连接到一个循环水浴(Lauda, PMS, 于 25和1700 µmol/(m2·s 光

10、强下测定. 叶绿素用 80%丙酮在暗下5提取, 按Arnon 方法测定和定量.1.3 叶绿素荧光室温Chl a 荧光以脉冲调制荧光仪(PAM 101-103, Walz, Germany测定. 叶片预先暗适应20 min. 测定用的调制光、作用光和饱和脉冲光分别为0.07, 200s. 最大光化学效率Fv/Fm, PS电和6000 µmol/(m2·第5期 林植芳等: 两个新的水稻缺叶绿素b 突变体光合作用的热稳定性 397应中心的失活和LHC 复合体从PS 解离之故, 但目前对两个缺Chl b 水稻突变体Fo-T 曲线异乎寻常的原因尚不清楚 .图2 野生型和两种缺Chl

11、b 突变体叶的Fo-温度曲线温度以0.5/min的速率升高图1 高温处理后野生型和两个缺Chl b 突变体水稻叶片光合放氧速率(a和叶绿素含量(b的变化 2.2 Fo-温度曲线2.3 叶绿素荧光参数在处理温度低于36之前, Fv/Fm在野生型及两种缺Chl b 突变体中没有明显的差别, 进一步升温导致Fv/Fm和Fv/Fo的急剧降低, 48时两个参数皆很小, Fv/Fm在48时仅为28时的36%(野生型 和10%11%(突变体(图3(a和(b. 在4248间野生型和突变体Fv/Fm的下降速率分别为0.082/和0.1270.134/.在2848范围内PS 在野生型和两种突变体中持续降低, 突变

12、体的PS 为28时初始值的7% 14%, 而野生型中仍能保留其初始值的25%(图3(c. Fm/Fo是反映LHC 漂移和激发能从PS 向PSI 满溢的指标. 从图3(d可见, 与温度有关的Fm/Fo水平变化的图式类似于Fv/Fm和Fv/Fo, 但在4448时野生型与两种缺Chl b 突变体之间的差别变小, 结果表明缺Chl b 突变体的PS 受高温失活作用快于野生型. 上述各参数出现明显下降的温度在3640之间, 约比Fo 快速上升的折点温度低10. qP 随温度上升而降低, 尤以44之后降低更快. VG28-1, VG30-5和野生型的qP 降低50%的温度分别为45, 45.5和47(图4

13、(a . 提高温度从28到40刺激 398中国科学 C 辑 生命科学第34卷图 3 高温对野生型和缺Chl b 水稻突变体叶片的Fv/Fm (a, Fv/Fo (b, PS (c, Fm/Fo (d的影响图4 高温对野生型和突变体叶中qP (a, NPQ (b, Yn(c和Fs/Fm(d的影响第5期林植芳等: 两个新的水稻缺叶绿素b 突变体光合作用的热稳定性 399了一种保护性热耗散功能NPQ 增强, 野生型的NPQ 提高了82%而两种突变体提高了37%52%. 48处理后突变体的NPQ 完全丧失, 但野生型仍保持初始值的18%(图4(b.NPQ 量子产额的指标Yn 的变化趋势除44具最大值之

14、外, 与NPQ 的变化相似, 低于40处理的野生型和两种缺Chl b 的突变体之间的Yn 几无差别(图4(c. Fs/Fm代表PQ 库还原的相对水平, 40以下Fs/Fm略有变化, 从40升到48期间Fs/Fm急剧升高(图4(d. 两个突变体的Fs/Fm比野生型高10% 15% (48 或29%50%(40. 可见, 温度超过40将导致PS 开放的反应中心及PQ 库相对水平的明显降低, 此时qP 和NPQ 的丧失与图1的光合放氧能力的丧失相符.响. 35暗处理30 min, 突变体和野生型皆有正常的叶绿体结构, 外膜完整、基粒垛叠清晰(图5(a(c. 温度升至45时, 野生型的叶绿体结构不变而

15、突变体的叶绿体肿胀, 部分基粒结构开始模糊或消失(图5(d(f. 55处理下所有的叶绿体皆明显肿胀, 突变体的叶绿体内部结构扭曲变形, 出现大量嗜锇颗粒, 野生型基粒排列则出现轻度的混乱(图5(g(i.35下无论野生型或缺Chl b 突变体均有明显的典型基粒和间质类囊体(图6(a(c. 然而45暗处理已使缺Chl b 突变体的基粒垛叠开始变得模糊不清(图6(e和(f. 55下野生型和突变体的基粒和间质类囊体肿胀, 并呈不同程度的破坏. 野生型的叶绿体中大多数类囊体仍具一定程度的垛叠结构(图6(g, 而缺Chl b 突变体的类囊体则显著膨大扭曲, VG30-5的基粒结构完全被破坏(图6(h和(i

16、, 这些结果说明缺Chl b 突变体对热胁迫的敏感性比野生型强. Vani等人19指出水稻品种Kalinga 在40暗下24 h后, 叶绿体的类囊体显著地呈现松散状态. Gounaris等人也报道常规的蚕豆品种经5055处理后类囊体膜 2.4 叶绿体超微结构的变化图5显示高温对叶绿体和类囊体超微结构的影 图5 不同温度下水稻叶片的叶绿体电子显微镜观察(a(c 野生型(a和缺Chl b 突变体VG28-1(b, VG30-5 (c经35处理后的叶绿体具大量典型的垛叠基粒; (d(f 45处理者, 突变体(e和(f的叶绿体肿胀, 基粒数少; (g(i 55处理者, 叶绿体呈卵形, 两个突变体的叶绿

17、体(h和(i的内部结构紊乱, 出现嗜锇颗粒. 所有照片放大12000×图6 经高温处理的水稻叶片基粒类囊体超微结构的电子显微镜图(a(c 35下野生型(a和突变体(b和(c中正常的基粒垛叠; (d(f 两种突变体的基粒在45下变小, 部分类囊体膜粘连(e和(f; (g(i 野生型水稻的基粒类囊体松散(g, 突变体的基粒结构紊乱(h或垛叠完全消失(i. 放大倍数60000×400 中国科学 C 辑 生命科学 第 34 卷 完全破坏, 低于 35则无明显的变化. 可见, 热胁迫 引起叶绿体超微结构的无序状态和改变的程度与植 物材料及处理条件有关. 热伤害已被归于PS氧化端的不可

18、逆变化 2 、 D1蛋白的降解6、PS氧化还原态失衡与电子从 Q B 到QA的反向传递4,21, 以及类囊体膜可能产生脂质过 氧作用 22 等. 文中Pn和PS随温度升高而下降的类 似趋势说明光合电子传递受抑制可能是高温抑制光 合 作 用 的 首 要 事 件 . 而 在 44 处 理 后 Fv/Fm保 持 75%78%, qP保留 58%72%与Pn的负值的不一致性 则表明热胁迫下失去光合能力可能包括一些光合作 用碳代谢关键酶类的失活. 实际上, 在 2545之 间, 纯化的Rubisco的三级和/或四级结构及活性已出 现显著的变化, 45被视为Rubisco耐热性的温度上 限 23. 两种新

19、的缺Chlb突变体经 44处理后Fv/Fm, qP和NPQ开始迅速下降, 48处理时qP和NPQ完全丧 失的结果, 与叶绿体类囊体垛叠的严重破坏和Fo快 速提高相符, 显然, 强高温引起了叶绿体结构与功能 的破坏. 我们试验用的两种新的缺Chlb的水稻突变体 的叶绿体缺少主要的捕光蛋白复合体LHC及CP26, 并在 77 K下有较高的F685/F72011. 在LHC内的热耗 散能力主要与外周的三聚体LHC多肽有关 24. 大麦 缺LHC的突变体中已发现PS和PS激发态相对 速率之间的严重失衡25. 此外, LHC缺乏对热胁迫 下PS电子供体端的稳定性也有显著的影响8. 因此, 两 种 缺 C

20、hlb的 突 变 体 对 高 温 的 较 高 敏 感 性 与 其 缺 Chlb和主要的捕光蛋白复合体组分而导致高温下PS 功能和结构的较低稳定性. 高温下PS的失活可 从叶绿体超微结构的变化给予佐证(图 6. 野生型水 稻表征叶绿体功能活性的多种参数在 48时的数值 极低, 而叶绿体超微结构则在高达 55时才出现显 著的改变, 这表明叶绿体超微结构在热胁迫下比PS 功能活性更为稳定. H2O2 是活性氧类之一, 可作为逆境信号分子及 植物中具潜在有害的化合物 26. 烟草 27 、芥 28 和水 稻 29 幼苗受中度热胁迫时叶片中H2O2 先升高, 接着 抗氧化能力被诱导增强, 因而H2O2 被认为参与热适 应的信号转导过程. 最近, Georgieva等人20报道大