三七皂苷对人骨髓造血细胞凋亡相关蛋白表达的影响

1、三七皂苷对人骨髓造血细胞凋亡相关蛋白表达的影响(1)        作者：陈小红，高瑞兰，郑智茵，钱煦岱，徐卫红 【摘要】【关键词】 造血细胞Expression of Apoptosis-related Proteins in the Human Bone Marrow Hematopoietic Cells Treated by Panax NotoginosidesAbstract The study was aimed to investigate the action of Panax Notoginos

2、ides (PNS，extracted from notoginseng herb) on the expression of the apoptosis-related proteins (Daxx，Fas) and transcription factors (NFkB、c-Rel) in the hematopoietic cells and to explore the mechanisms of supporting cells to survive.The colony formation of CFU-GM and CFU-E in human bone marrow was a

3、ssayed in the presence of various concentrations of PNS.The viability of cells was assayed by trypan blue and the changes of cell morphology were observed with microscope.The Annexin-V positive cells were detected by FCM.Three lineages of human myeloid HL-60，erythroid K562，megakaryoid CHRF-288 and M

4、eg-01 cells were incubated in addition of PNS（10 mg/L）for 14 days.The nuclear or cytoplasm protein of cells was extracted and analyzed by Western blot with monoclonal antibodies against Daxx，Fas or NFkB，c-Rel.The results showed: (1)the proliferation on hematopoietic progenitor ce

5、lls （CFU-GM and CFU-E） and four cell lines was promoted by PNS; (2) after the four cell lines were promoted by PNS and hungered through wiping off the sera，the viability of the four cell lines was high without significant morphological change and neither the detection of Annexin-V positive cells; (3

6、) the expression of Daxx and Fas protein could be inhibited by PNS.Western Blot showed that Daxx in four cell lines treated by PNS were 33.3-61.5% lower than that in untreated controls.The Fas protein was also descended in three cell lines of K562，CHRF-288 and Meg-01 by 33.3-71.4% respectively，while

7、 Fas protein in HL-60 cells was no detectable difference after PNS treatment.(4) The transcription factors NFkB and c-Rel protein could be increased by PNS.The NFkB、c-Rel protein were also enhanced in three cell lines of K562，CHRF-288 and Meg-01 by (2.0-2.7) and (1.5-2.3)-fold respectively，while the

8、re were also no detectable difference in HL-60 cells after PNS treatment.It is concluded that PNS inhibites the expression of Daxx and Fas proteins，may decrease the apoptosis of the hematopoietic cells.The level of NFkB and c-Rel proteins can be enhanced by PNS，which not only stimulates the prolifer

9、ation of cells，but also inhibits the activity of the waterfall of caspase and apoptosis of the hematopoietic cells. PNS may treat the disease with over-apoptosis of hematopoietic cells，as aplastic anemia.Key words PNS; Hematopoietic Cell; Daxx; Fas; NFkB; c-Rel; aplastic anemia   

10、0;细胞凋亡是一种程序性细胞死亡，与细胞增殖及分化一起维持着多细胞机体的稳态，具有重要的生理功能。近年来研究表明，再生障碍性贫血（AA）患者骨髓造血干细胞或祖细胞（CD34 ），及单个核细胞（MNC）凋亡增加，Fas和FasL表达也明显增高，提示AA患者的发病与Fas、FasL系统有关1，2。三七皂苷（PNS）是中药三七的主要活性成分，我们已报道了PNS能够刺激人骨髓红系、粒系造血祖细胞增殖和分化3，改善再生障碍性贫血小鼠的骨髓抑制并促进造血细胞增殖等4。本研究通过观察PNS处理前后对造血细胞凋亡相关的Daxx、Fas蛋白和核转录因子NFkB、c-Rel表达的影响，以探讨PNS促进造血细胞增殖

11、，支持生长存活的作用机制，为临床应用提供可靠的理论依据。材料和方法药物三七皂苷注射液半固体造血祖细胞集落培养及PNS刺激试验将正常的人骨髓标本按本室已建立的方法作粒系祖细胞（CFU-GM）、红系祖细胞（CFU-E）培养，体系分别含粒单核细胞集落刺激因子10 g/L（Strathmann）或红细胞生成素2 000 U/L（麒麟鲲鹏中国生物药业），再加20小牛血清（杭州四季青生物工程公司）和3 g/L琼脂（Promega）的IMDM培养液。混匀后接种至24孔培养板，作3个复孔，均含105有核细胞/（0.5 ml·well)。细胞株HL-60、K562、CHRF-288和Meg-01细胞的

12、集落培养同上述人骨髓，但不加造血生长因子，接种 5×104有核细胞/（0.5 ml·well)。上述体系均分别加入PNS，终浓度为0、5、10、20和50 mg/L。培养7天后计数CFU-GM（>40个细胞）、CFU-E集落（>8个细胞）和细胞株的集落（>20个细胞）。 本篇论文是由3COME文档频道的网友为您在网络上收集整理饼投稿至本站的，论文版权属原作者，请不要用于商业用途或者抄袭，仅供参考学习之用，否者后果自负，如果此文侵犯您的合法权益，请联系我们。人的造血细胞株液体培养及PNS诱导处理用HL-60、K562、CHRF-288和Meg-01 4种细胞

13、株作为靶细胞，常规培养在含10%小牛血清的IMDM中，选择小剂量PNS（10 mg/L）孵育细胞作为实验组，对照组不加PNS，培养2周后备用。台盼蓝染色、形态学观察和Annexin V分析取培养2周后的细胞作饥饿处理，再加入较高浓度的PNS（30 mg/L）刺激细胞2小时，然后分别作台盼蓝染色，计算细胞存活率。细胞悬液经离心涂片机制片，瑞氏染色，油镜下观察细胞形态。Annexin V分析在细胞悬液中加入Annexin V-FITC 5 l。避光孵育30分钟，用流式细胞仪分析Annexin V阳性的凋亡细胞。细胞浆蛋白和核蛋白的提取取培养2周后细胞作饥饿处理，再加入较高浓度的PNS（30 mg/

14、L）诱导细胞2小时后，离心弃上清，用冷PBS洗涤后，悬浮在缓冲液A中含蛋白酶抑制剂（Sigma）: 亮抑肽酶（leupeptin）、抗蛋白酶(antipatin)、抑蛋白酶肽(aprotinin)和抑胃酶(pepstatin)，均为10 g/ml，经振荡后破碎细胞膜，收集浆蛋白；将沉淀物即细胞核悬浮在含蛋白酶抑制剂缓冲液C中，超声波粉碎仪破碎细胞核，离心沉淀取上清收集核蛋白。加入蛋白质显色剂 (Bio-Rad) 测定浆蛋白和核蛋白浓度，分装，-70保存备用。由于需要较长时间诱导细胞株，故先用低浓度PNS（10 mg/L）作用14天，再用较高浓度PNS（30 mg/L)刺激细胞2小时，然后提取核

15、蛋白。Daxx、Fas表达和NFkB、C-Rel表达的Western blot分析按本实验室已报道的方法5，将提取的细胞浆蛋白或核蛋白20 g加入SDS凝胶加样缓冲液20 l中，煮沸后，用7.5%的SDS-PAGE凝胶分离，电压100 V，电泳150分钟，然后将已分离的蛋白条带转移到PVDF膜上，用含1%牛血清白蛋白（BSA）的TBS-T缓冲液封闭60分钟，分别加入以下特异性抗体（Santa Cruz产品）包括Daxx（C-20）、Fas（C-20）、 NFkB（C-19）和C-Rel（C），抗体终浓度0.5 mg/L，室温作抗原抗体结合反应70分钟，经TBS-T缓冲液洗涤3遍后，分别加辣根过

16、氧化物酶标记的山羊或兔二抗（Santa Cruz产品，15 000稀释）作用45分钟，充分洗涤后，用ECL发光剂（Santa Cruz产品）作用1分钟，X线胶片曝光，显影后作图像扫描进行分析，同样实验重复3遍。    结果PNS促进造血细胞增殖PNS刺激正常人骨髓造血祖细胞的增殖作用在低浓度5 mg/L时就起效，10、20和50 mg/L时实验组集落数均明显多于对照组（P均<0.01），CFU-GM、CFU-E的提高率分别为39.1%-41.9和31.9%-35.3，3组之间无显著差异。PNS对4株细胞的作用在低中浓度10、20 mg/L时最明显，

17、CFU-GM、CFU-E的集落提高率分别为24.1%-30.2和23.3%-31.7，明显高于对照组（P均<0.01）。PNS在较高浓度50mg/L时的作用不如10、20 mg/L时明显（图1）。PNS较长时间地处理后细胞存活率、形态学和Annexin分析4株细胞先经小剂量PNS（10 mg/L）诱导2周，作饥饿处理后，再加入较高浓度的PNS（30 mg/L）刺激2小时，然后取细胞作台盼蓝染色试验，结果显示在PNS处理前后4株细胞的存活率均在96%以上；显微镜下观察细胞形态无异常，未观察到凋亡的形态学特征，如染色质浓聚而形成致密的染色质团块，胞质空泡化，核固缩和破碎，及凋亡小体等；流式细

18、胞术Annexin分析也未见凋亡的阳性细胞，上述结果均提示细胞经PNS诱导和饥饿处理后仍保持良好的活性状态。PNS对Daxx、Fas蛋白表达下调的作用Western blot分析显示细胞的Daxx、Fas蛋白抗原分别与Daxx、Fas抗体结合反应的特异性条带，相对分子量为120 kD、45 kD，与Daxx、Fas蛋白相符。经PNS诱导后3个系列4株细胞的Daxx蛋白量均下降。经密度分析，与未经处理细胞相比Daxx蛋白表达分别下降了50%、58.3%、33.3%和61.5%。而Fas蛋白表达则不尽相同，HL-60细胞的Fas表达在PNS诱导前后无明显变化，而K562、CHRF-288和Meg-01 3株细胞则出现Fas表达下降，与对照相比分别下降了71.4%、33.3%和56.5%（图2）。PNS诱导NFkB转录因子和c-Rel蛋白表达增高讨 论文献报道对PNS的研究较多集中在心血管系统，它具有强心、扩张冠状动脉、改善心肌代谢、抗自由基、抗凝、钙拮抗等作用，而在造血方面研究较少。王亚平等6报道，PNS在体外通过诱导红系、粒系分泌造血调节因子，间接地促进血细胞生成。邹丹等7报道，PNS可明显地对抗60Co 射线照射小鼠的实验性骨髓抑制。我们以往的工作也显示，PNS不但促进CD34造血干细胞增殖，使CFU