快速诊断单纯疱疹病毒脑炎

1、快速诊断单纯疱疹病毒脑炎徐云鹤照日格图王树欣闫静吴沪生马云陈燕华 【摘要】目的探讨快速诊断单纯疱疹病毒脑炎(HSE),比较不同病毒学试验的诊断价值。方法用聚合酶链反应技术检测177例急性脑炎患儿的脑脊液(CSF)标本中单纯疱疹病毒(HSV)特异性DNA; 用酶联免疫吸附方法检测CSF和血清标本中HSV特异性IgM和IgG抗体。结果CSF中HSV特异性DNA、IgM和IgG抗体阳性率分别为1.7%(3/177)、1.0%(1/100)和47.0%(47/100),血清HSV-IgM、IgG抗体阳性率分别为12.5%(6/48)、72.9%(51/70)(因为标本量不足或缺如,未能对全部病例进行抗

2、体检测);3例患儿确诊为HSE。结论用套式PCR检测CSF诊断HSE较敏感、特异。 【关键词】脑炎，病毒性单纯病毒属诊断 Rapid diagnosis of herpes simplex virus encephalitisXu Yunhe*, Zhaori Getu, Wang Shuxin, et al. *Virology Laboratory, Beijing Pediatric Research Institute, Beijing 100045 【Abstract】ObjectiveTo evaluate different virological diagnostic test

3、s in rapid diagnosis of herpes simplex encephalitis (HSE). MethodsPolymerase chain reaction (PCR)techniques, including nested PCR were used to detect herpes simplex virus (HSV)-specific DNA in cerebrospinal fluid of 177 children with acute encephalitis; enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) wer

4、e applied to detect HSV-specific IgM and IgG antibodies in CSF and serum specimens. ResultsHSV DNA, specific IgM and IgG class antibodies to HSV were positive in 1.7%(3/177), 1.0%(1/100) and 47.0%(47/100) cases, respectively; serum IgM and IgG antibodies to HSV were positive in 12.5%(6/48) and 72.9%

5、(51/70) cases, respectively. (Because of inadequacy or absence of CSF or serum specimens in certain cases, the antibody detection could not be performed for every case involved in this study.) Three cases were confirmed as HSE patients. ConclusionThe nested PCR technique for detection of HSV DNA in

6、CSF was relatively sensitive and specific. 【Key words】Encephalitis, viralSimplexvirusDiagnosis 早期诊断单纯疱疹病毒脑炎（HSE）和采用抗病毒药物治疗能明显改善HSE患儿的预后。从1990年开始，国外有人用聚合酶链反应（PCR）检测脑脊液（CSF）中单纯疱疹病毒（HSV）DNA诊断HSE14。1990年,莫红梅等5报告检测CSF中特异性IgM抗体早期诊断疱疹性脑炎。1993年，候熙德等6报告用PCR诊断HSE。作者通过本项研究比较不同病毒学试验在诊断HSE中的意义。 资料和方法 一、资料和标本 177

7、例临床拟诊为急性病毒性脑炎的本院住院患儿;男127例，女50例；年龄5.84.0岁（4天14岁）。每例至少有1份CSF标本, 70例至少有1份血清标本。CSF和血清标本立即检测或存放于-20待检。 二、PCR 用HSV型共用PCR、单纯疱疹病毒-1型(HSV-1)套式PCR和单纯疱疹病毒-2型(HSV-2)套式PCR检测全部患儿的CSF标本。标本处理和套式PCR条件基本同文献7,每次试验都设阳性对照和阴性对照。套式PCR引物由瑞典传染病控制研究所Wahren和Linde教授赠送,引物序列同文献3，4。HSV型共用PCR引物序列同文献2, 其中引物I序列为: CAG TAC GGC CCC GA

8、G TTC GTG; 引物II序列为: GGC GTA GTA GGC GGG GAT GTC GCG。该引物选自HSV-1、HSV-2的DNA聚合酶基因,扩增的HSV-1或HSV-2 DNA片段都为330 bp，这些片段内分别有限制性内切酶Xho I和Bgl II的识别位点。引物在中国预防医学科学院病毒学研究所和北京赛百盛生物工程公司合成。 CSF标本的预处理: 10 l CSF标本中加1滴矿物油, 100加热15分钟。HSV-1和HSV-2的套式PCR按文献7进行, 两次PCR反应总体积均为50 l; 第1次PCR进行20个循环, 取其产物2.5 l, 做第2次PCR(30个循环)。取第2

9、次PCR的产物10 l,加样于2.5%的琼脂糖凝胶(含溴化乙锭)上电泳, 紫外线下观察结果。HSV型共用PCR的反应总体积为50 l, 循环35次, 每个循环包括94变性30秒钟, 55复性30秒钟, 72延伸1分钟。PCR循环开始前先在94变性5分钟, 循环结束后在72延伸5分钟。然后取PCR产物10 l, 进行电泳并观察结果。HSV型共用PCR阳性产物用限制性内切酶法分型: 将16l PCR扩增产物分别与2 l 限制性内切酶Bgl II或Xho I（购自华美生物工程公司）及2 l 酶反应缓冲液混合, 37反应1小时；在2.5%琼脂糖凝胶上电泳,紫外线灯下观察结果。 三、HSV特异性IgM抗

10、体（HSV-IgM）检测 用酶联免疫吸附法(ELISA)（德国HUMAN公司药盒）检测CSF和血清中的HSV-IgM, 检测步骤要点是:在已用HSV-1和HSV-2抗原包被好的ELISA反应板孔中加入系列稀释的标本(标本稀释液中含抗人IgG抗体, 用以消除类风湿因子的干扰), 在室温下孵育30分钟, 洗涤后加抗人IgM酶标记抗体, 室温孵育30分钟, 洗涤后加酶底物溶液, 室温反应15分钟,终止反应并测定吸光度。每批试验均设阳性、阴性和空白对照。 四、HSV特异性IgG抗体（HSV-IgG）检测 检测方法同文献7, 其要点是:在已用HSV抗原包被好的ELISA反应板孔中加入系列稀释的标本, 3

11、7反应1小时, 洗涤后加抗人IgG酶标记物, 37反应1小时, 洗涤后加底物显色, 以酶联仪读取光密度。每批试验均设阳性、阴性和空白对照。 五、确诊为脑炎病毒病原的标准 1. CSF病毒特异性IgM阳性。 2. CSF病毒DNA阳性。 3. 病毒特异性IgG滴度血清/CSF比值20。 4. 恢复期CSF病毒特异性IgG滴度4倍升高。满足4项中的任何1项即判定该病毒为脑炎病原。 结果 一、HSV型共用PCR和分型 HSV型共用PCR能扩增HSV-1(Stock株)和HSV-2(Sav株)对照,与EB病毒、巨细胞病毒、水痘带状疱疹病毒和人类疱疹病毒6型无交叉反应。本研究中确诊为其他病毒脑炎患儿的C

12、SF标本其共用PCR检查结果都为阴性。HSV-1阳性对照的HSV型共用PCR扩增产物能被Xho I切下90个碱基的片段，HSV-2阳性对照PCR产物能被Bgl II切下80个碱基的片段；此结果与HSV-1、HSV-2基因序列相符8，9。 二、HSV病毒学试验(附表)和患儿临床情况 3例患儿的CSF标本HSV-DNA阳性,确诊为HSE。第1例HSV型共用PCR阳性，分型为HSV-1;HSV-1套式PCR也阳性,HSV-2套式PCR阴性;CSF标本HSV-IgM阳性,恢复期CSF检测结果显示HSV-IgG滴度升高4倍；HSV-IgG滴度血清/CSF比值 20;血清HSV-IgM阴性。另2例HSV-

13、1套式PCR阳性, HSV-2套式PCR阴性, HSV型共用PCR阴性, CSF和血清HSV-IgM都阴性。第1例治疗前脑CT有明显异常, 显示前额及右颞部有小片状低密度影, 经用阿昔洛韦治疗14天, 病情无明显好转, 自动出院, 出院前复查头颅CT, 基本同第1次检查所见;第2例治疗前脑CT检查显示右顶部斑片状低密度灶, 该例亦经阿昔洛韦治疗14天, 距第1次CT检查16天时复查CT, 见病变明显吸收。第3例患儿入院第2天接受头颅CT检查, 未见异常, 经阿昔洛韦及综合治疗顺利恢复。后2例患儿均痊愈出院。 附表HSV病毒学试验结果 病毒学 试验 CSF 血清 例数 阳性 例数 阳性率 (%)

14、 例数 阳性 例数 阳性率 (%) HSV-DNA 177 3 1.7 - - - HSV-IgM 100 1 1.0 48 6 12.5 HSV-IgG 100 47 47.0 70 51 72.9 讨论 一、型共用PCR和套式PCR的比较 在许多关于HSE诊断的临床研究中,用PCR能从患儿的CSF中检出HSV DNA。本研究中的HSV型共用PCR具有HSV型共用性和病毒特异性,与套式PCR相比耗时较少、成本较低、交叉污染的可能性较小;但是, 3例确诊为HSE的患儿中仅1例病情最重者HSV型共用PCR阳性;提示该HSV型共用PCR诊断HSE的敏感性不如套式PCR ,有出现假阴性的可能。用套式

15、PCR也许可以发现更多的轻症患儿和早期患儿。因此，为了更好地诊治患儿,作者认为还是选用套式PCR诊断HSE为宜。该结果与候熙德等6的报告一致 。 二、对HSE早期诊断的重要性 早期诊断和尽早开始进行抗病毒治疗对降低HSE死亡率和减少后遗症非常重要。本研究中2例HSE患儿能痊愈出院即主要得益于较早入院(分别于发病第2、4天)得到确诊和抗病毒治疗。对于临床拟诊为HSE的患儿应立即开始抗病毒治疗,不必等待病毒学试验结果。用套式PCR能从已接受阿昔洛韦治疗25天的HSE患儿的CSF中检测出病毒DNA,有些标本的阳性信号甚至变得更强3。 三、只有血清HSV-IgM抗体阳性不能作为HSE的诊断依据 本研究

16、中有6例(6/48,12.5%)患儿的血清HSV-IgM阳性,但是其他病毒学试验结果不支持HSV为脑炎的真正病原,其中3例有其他病毒急性感染的病毒学试验证据(1例确诊为EB病毒脑炎, 1例确诊为肠道病毒脑炎)。我们推测, 有时血清HSV-IgM阳性也许与其他急性病毒感染激活体内潜伏的HSV或触发HSV抗体反应有关。类似的情况也见于莫红梅等5的报告中。这些结果提示,血清HSV-IgM阳性也许不能作为确诊HSE的依据,似值得临床医师注意。仅CSF HSV-IgG阳性不是诊断HSE的依据,本研究中CSF、血清HSV-IgG阳性率分别达47.0%、72.9% ,一般认为血清中的IgG能透过血脑屏障进入

17、CSF。 本研究结果提示, CSF标本HSV-IgM阳性是确诊HSE的依据,但是其诊断的敏感性似有待进一步评价; CSF中的HSV-IgM是在局部产生的,而非来自血液。3例HSE患儿血清HSV-IgM都阴性是偶然现象,还是反映了HSV感染脑实质并非经血液而是有特殊的传播途径,尚不清楚。 本研究受北京市科技干部局青年科技骨干培养基金资助 作者单位：100045 北京儿童医院,北京儿科研究所病毒室(徐云鹤、王树欣、闫静)；北京儿童医院儿童神经内科(吴沪生)，传染病科(马云、陈燕华)； 中国医学论坛报社(照日格图) 参考文献 1Rowley AH, Whitley RJ, Lakeman FD, e

18、t al. Rapid detection of herpes simplex virus DNA in cerebrospinal fluid of patients with herpes simplex encephalitis. Lancet, 1990,335:440-411. 2Kimura H, Futamura M, Kito H, et al. Detection of viral DNA in neonatal herpes virus infections: frequency and prolonged presence in serum and cerebrospin

19、al fluid. J Infect Dis, 1991,164:289-293. 3Aurelius E, Johansson B, Skolderberg B, et al. Rapid diagnosis of herpes simplex encephalitis by nested polymerase chain reaction assay of cerebrospinal fluid. Lancet, 1991,337:189-192. 4Aurelius E, Johansson B, Skolderberg B, et al.Encephalitis in immunocompetent patients due to herpes simplex virus type 1 or 2 as determined by type-specific polymerase chain reaction and antibody assays of cerebrospinal fluid. J Med Virol, 1993,39:179- 186. 5莫红梅,张礼璧. 检测脑脊液中特异性IgM抗体用于早期诊断疱疹脑炎的研 究. 中华神经精