用跨越断裂点的PCR技术快速诊断一种HPFH缺失突变

1、    用跨越断裂点的PCR技术快速诊断 一种HPFH缺失突变        【摘要】目的建立一种简便快速检测缺失型遗传性持续性胎儿血红蛋白综合征(hereditary persistence of fetal hemoglobin，HPFH)的PCR基因诊断技术。方法基于本室通过序列测定获得的该基因断裂点周围新的DNA顺序资料，采用跨越断裂点的三引物双重PCR设计方案，1个共用引物与2个分别针对正常和突变基因的引物在单管反应中构成2对特异性的PCR反应。结果2个特

2、异性扩增片段分别为565bp和376bp，与预期的PCR产物大小相符，其中565bp为正常等位基因的扩增产物；376bp产物示缺失型等位基因。此三引物双重PCR可在同一反应体系中进行，其结果能区别样品的不同基因型。结论该法简便快速，可作为常规方法用于临床疑诊样品的分子筛查。【关键词】遗传性持续性胎儿血红蛋白综合征聚合酶链反应-珠蛋白基因 Rapid Detection of an HPFH Deletion by PCR Amplificationwith Three Primers Bridging the BreakpointLIU Zhongying, ZHONG Xionglin, L

3、I Zhiqin, XU Xiangmin*.* Institute of Molecular Biology, First Military Medical University, Guangzhou,【Abstract】ObjectiveTo establish a rapid and reliable PCR method for detecting a deletional hereditary persistence of fetal hemoglobin (HPFH) found in Chinese. MethodsBased on some novel DNA sequence

4、s across the 3breakpoint of a HPFH deletion observed in our laboratory, we designed a PCR amplification with three primers bridging the breakpoint. In this system, oligonucleotide primers have been chosen which allow specific identification of both normal and deletional chromosomes under identical c

5、ondition in either the same or parallel PCR reactions. ResultsThe expected two specific amplification bands were produced; one was 565bp in length and stood for the normal alleles, the other, 376bp in length represented the mutant alleles of -globin gene cluster. This duplex system could directly ge

6、notype DNA samples bearing this type of HPFH deletion. ConclusionThis rapid and inexpensive method could be used as a routine method in the molecular screening of carriers and for the prenatal diagnsis of this disease.【Key words】Hereditary persistence of fetal hemoglobinPolymerase chain reaction-glo

7、bin gene遗传性持续性胎儿血红蛋白综合征(hereditary persistence of fetal hemoglobin, HPFH)和-地中海贫血(-地贫)是一组遗传异质性很大的血红蛋白病1，-珠蛋白基因簇的大段缺失是导致该病的重要基因类型，该类型基因还是组成临床较常见的中间型地贫的主要病理缺陷之一。目前，在中国人中至少发现了4种此类缺失型基因2，本文涉及的缺失型HPFH曾先后在澳大利亚和美国的越南和柬埔寨裔患者及我国浙江籍病例中发现3,4。虽然该基因的缺失范围已经确定，但其基因断裂点尚未完全阐明。我们最近在广东籍2例HPFH疑诊患者中克隆到这一基因，并测定了该基因3端断裂点周围

8、的DNA顺序，基于该新的DNA顺序，我们设计了PCR引物。此法的建立可为临床中间型地贫及其它一些血红蛋白病的鉴别诊断提供一种简便快速的分子诊断方法和有价值的策略。1材料与方法1.1DNA样品2份HPFH病例DNA为经基因分析确诊的缺失型HPFH杂合子样品，其缺失类型见文献3,4；正常样品为本室保存的正常人白细胞DNA。DNA样品按氯仿酚抽提法或DNA快速抽提法5从人白细胞中提取。1.2引物设计3个引物的碱基顺序依据我们最近测定的上述缺失型HPFH基因3端断裂点周围的新DNA序列结果和GenBank HUMHBB，分别为：5ATTGTTGAGTTGCAGGATCG3(HPFH-W)，5TGGTA

9、TCTGCAGCAGTTGCC3(HPFH-M)和5AGCCTCATGGTAGCAGAATC3(HPFH-C)。引物的合成采用亚磷酸三酯法(上海赛尔生物技术公司)。HPFH-W位于3端断裂点附近的上游，HPFH-M位于该缺失基因5端断裂点附近的上游，共用引物HPFH-C位于3端断裂点附近的下游。这样，在正常等位基因上，HPFH-W与HPFH-C形成一对PCR引物，其扩增产物为565bp，而在缺失等位基因上，由于HPFH-W无结合位点而致反应阴性；相反，HPFH-M与HPFH-C虽然在正常等位基因上都有结合位点，但因二者相距太远(5和3端断裂点之间的DNA片段为30kb)使无法形成PCR反应，而

10、在缺失等位基因，此对引物因该基因片段缺失而靠近，其扩增产物为376bp。1.3PCR条件Taq酶和PCR反应Buffer购自复日公司(复旦大学)，dNTP为德国Boehringer Mannheim产品；50l反应总体积中含：0.2g基因组DNA，每种dNTP 100mol/L，和Taq酶2U。分管反应时每种引物为0.3mol/L，进行双重PCR时，HPFH-W和HPFH-M均为0.3mol/L，HPFH-C为0.6mol/L，其它条件相同。PCR在PE-480(美国Perkin-Elmer公司)扩增仪上进行，循环参数为：945分钟，574分钟(期间加入Taq聚合酶)，723分钟；以下进行30

11、个循环：9450秒，571分钟，721分钟10秒，最后一个循环728分钟。取出后4存放待检测。PCR产物用6%聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。紫外灯下观察结果，拍照留底。2结果和讨论2.1我们设计的检测体系，在进行已知样品分析时，获得了预期的检测结果。HPFH-WHPFH-C和HPFH-MHPFH-C 2对引物分管反应的PCR扩增结果见1A。扩增产物的大小与经序列测定的结果一致。在此基础上，我们摸索出了在同一试管中进行双重PCR的条件，三引物双重PCR检测样品的结果见1B。2个特异性扩增片段分别为565bp和376bp，其中565bp为正常等位基因的扩增产物；376bp产物示缺失型等位基因。1PCR检

12、测HPFH缺失突变A：分管反应的结果，B：三引物双重PCR的检测结果Fig 1Detection of an HPFH deletion by PCRTwo PCR amplifications with threeprimers were run in two separate tubes (panel A) or in one tube under same condition(panel B). Panel A:amplified with primers HPFH-W/HPFH-C(lanes 1,3,5 and 7) orwith primers HPFH-M/HPFH-C(lane

13、s 2,4,6 and 8). M:pBR322/Hae DNAmarkers (SABC).Lanes 1, 2:negative control (no DNA); lanes 3,4: DNA from normalindividual; lanes 5,6 and 7,8:two patients' heterozygous DNAs bearing HPFH deletion;Panel B:amplified with three primers(HPFH-W, HPFH-M and HPFH-C)in duplexPCR system. Lane 1:negative c

14、ontrol (no DNA);lane2: DNA from normal individual;lanes 3,4: DNA of two same patients as in Panel A2.2目前临床诊断HPFH和-地贫主要依赖血液学分析1，通常需综合多项RBC和Hb指标才能作出诊断，且常难确诊。而采用基因诊断技术则可快速准确的得出结果。这一技术已用于检测-地贫和一些其它HPFH和-地贫基因6-8，目前的方法多采用2对引物分别反应的方式进行，我们采用单管双重PCR，不仅可节约试剂和简化操作，更重要的是增加了方法的可靠性。此三引物双重PCR可在同一反应体系中进行，其结果可直接检测出样

15、品的不同基因型。2.3我们的检测对象是目前已阐明分子基础的唯一一种中国人缺失型HPFH(其余为-地贫)，但从现有文献分析，这一缺失类型应属东南亚和中国南方较常见的HPFH基因2-4，因此，将本法用于该病临床样品的分子筛查是有必要的。此外，HPFH与-地贫复合可产生严重的贫血症，临床上一些中间型地贫病例在进行-地贫基因分析后仍难完全诊断，这是地贫基因诊断中值得注意的问题，采用本法进一步分析这类样品有助于获得最终诊断，同时也为-地贫复合HPFH家系病例的产前诊断提供了新方法。本法仅限于一种HPFH的检测，在阐明中国人该类疾病的分子病理的基础上，以相同策略设计针对不同缺失型的引物，结合多重PCR技术

16、，是挖掘本法发展潜力的重要内容之一。本课题受国家自然科学基金(批准号39670333)资助*课题负责人和联系人作者单位：刘忠英钟雄林李志琴徐湘民（510515 广州，第一军医大学分子生物学研究所；）参考文献1McDonagh KT,Nienhuis AW. The Thalassemias. In: Nathan DG Oski FA. eds. Hematology of infancy and childhood. 4th ed. Mexico:Saunders WB. Company, 1993. 783-879.2徐湘民.见于中国人的HPFH和-地中海贫血的分子基础.中华医学遗传学杂志

17、，1998，15(5)315-317.3Motum PI, Hamilton TJ, Lindeman R, et al. Molecular characterisation of Vietnamese HPFH. Hum Mutat, 1993, 2(3)179-184.4Dimovski AJ, Divoky V, Adkile AD, et al. A novel deletion of approximately 27kb including the -globin gene and the locus control region 3HS-1 regulatory sequence

18、: 0-thalassemia or hereditary persistence of fetal hemoglobin? Blood, 1994, 83(3)822-827.5Lahiri DK, Schnabel B. DNA isolation by a rapid method from human blood samples: Effects of MgCl2, EDTA, storage time, and temperature on DNA yield and quality. Biochem Genet, 1993,31(7-8)321-328.6Ko TM, Tseng LH, Hsieh FJ, et al. Rapid detection of ChineseG+(A)0-thalassemia by polymerase chain reaction. Acta Haematol, 1993,89(2)80-81.7Bowden DK, Vickers MA, Higgs DR. A PCR-based strategy to dete